高松林，韋柳婷，覃雁，吳美玲，黃萱，黃貴華（. 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000；. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

功能性便秘（functional constipation）是一種常見的以排便次數(shù)減少、排便困難為特點的功能性胃腸道疾病[1]。功能性便秘的診斷多依照羅馬標準，按照羅馬Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標準診斷的全球成人患病率分別為11.2%、10.4%和10.1%[2]；我國成人患病率分別為10.6%、6.5%和8.1%，女性患病率高于男性[3]。功能性便秘的病因尚不清楚，其發(fā)病機制與結、直腸動力及盆底肌功能、腦腸軸、腸道菌群、黏膜免疫功能改變等相關[4-8]。

現(xiàn)代醫(yī)學治療功能性便秘的主要方法是生活方式干預、藥物療法、生物反饋療法和手術治療等，具有良好的短期療效，但缺乏長期有效性和安全性[9-10]。

中醫(yī)治療功能性便秘注重整體觀念和辨證論治，療效確切，具有遠期療效佳、安全性強等優(yōu)勢[11-12]。中藥復方專利源于長期反復的臨床實踐，具有較好的療效和可重復性，為新藥研發(fā)的重要來源。

本研究整合數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法探討國家專利復方防治功能性便秘的用藥規(guī)律和作用機制，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 登錄國家知識產(chǎn)權局的中國專利公布公告網(wǎng)（http://epub.cnipa.gov.cn/），在高級查詢界面中同時選擇“發(fā)明授權”及“發(fā)明公布”選項，在“文本-名稱”或“文本-摘要/簡要說明”項目中輸入“功能性便秘”“慢傳輸型便秘”分別進行檢索。檢索時間范圍為建庫至2022 年9 月3 日。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：專利名稱或摘要或簡要說明中，明確指出用于功能性便秘的中藥復方專利。

1.2.2 排除標準：①用法為外用的專利（包括貼劑、熨燙劑、精油、灌腸等）；②專利處方中組成不明確且在中國知網(wǎng)專利數(shù)據(jù)庫下載全文后仍不能補充完整者；③食品、飲品、保健品類專利；④只有單味中藥的專利處方。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)一及錄入 參照《中藥學》[13]對藥名規(guī)范處理，未收錄的中藥則參考2020 年版《中華人民共和國藥典》[14]，若在二者中均未收錄則保留原名。如元參、麻仁、附片、雞屎藤、生地、熟地分別規(guī)范為玄參、火麻仁、附子、雞矢藤、生地黃、熟地黃；炒枳實、焦神曲分別規(guī)范為枳實、六神曲。雙人雙機分別在Excel 表中錄入和校對處方數(shù)據(jù)，組成相同的專利僅錄入1 次。將整理后的Excel 表導入中醫(yī)傳承計算平臺V3.0（TCMICS V3.0）進行數(shù)據(jù)挖掘。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用“TCMICS V3.0”平臺，在“方劑分析”模塊中選擇藥物頻數(shù)、關聯(lián)規(guī)則、聚類分析等功能對復方專利中藥物的頻數(shù)、組方規(guī)律等進行分析，運用Excel 表分析高頻藥物的性味歸經(jīng)和功效。

1.5 網(wǎng)絡藥理學分析 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 為條件篩選出核心高頻藥物組的活性成分和作用靶點，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），以Status 設為Reviewed、Popular organisms 設 為Human” 對 靶 點 進 行 規(guī) 范。 在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank數(shù) 據(jù) 庫（https://go.drugbank.com/）中 以“functional constipation”作為關鍵詞執(zhí)行檢索，合并去重后獲得功能性便秘的相關靶點。利用R 軟件進行Venn 分析獲取核心高頻藥組與功能性便秘的交集靶點，采用Cytoscape 3.8.0 構建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡并篩選關鍵活性成分。將交集靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設定生物種類為“Homo sapiens”， 最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（＞0.95），隱藏游離的靶點，構建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡模型，通過Cytoscape 3.8.0 對PPI 網(wǎng)絡進行分析。使用R 軟件對交集靶點進行富集分析。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫、PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心活性成分、關鍵靶點的結構，結合Chem3D 軟件、PyMol軟件、AutoDockTools 1.5.6 軟件進行預處理，運用AutoDockVina 1.1.2 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結果

2.1.1 專利復方檢索結果 初步檢索共獲得專利279 項，由于“文本-名稱”項目檢索出來的結果大部分都存在于“文本-摘要/簡要說明”項目檢索的結果中，故重復的復方專利較多，經(jīng)去重、篩選后共納入專利72 項。72 項復方專利的申請公布日或授權公告日為1998 年9 月30 日—2022 年8 月30 日。

2.1.2 高頻藥物頻數(shù)分析 見表1。72 項復方專利共涉及262 種中藥，總頻數(shù)達691 次，每項復方專利的中藥味數(shù)在2～40 味之間。高頻藥物有白術（26 次，36.11%）、甘草（24 次，33.33%）、肉蓯蓉（20 次，27.78%）、枳實（19 次，26.39%）、當歸（19 次，26.39%）、火麻仁（18 次，25.00%）等20 味。

表1 防治功能性便秘專利中藥復方的高頻藥物統(tǒng)計（頻數(shù)≥10 次）Table 1 High-frequency statistics of patented Chinese herbal compounds for the treatment of functional constipation（frequency ≥10）

2.1.3 高頻藥物功效分析 見表2。對20 味高頻中藥進行功效分類統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)補虛藥最多，其次是理氣藥和清熱藥，隨后依次是瀉下藥、化濕藥和活血化瘀藥。

表2 治療功能性便秘專利中藥復方的藥物功效頻數(shù)統(tǒng)計（頻數(shù)≥11 次）Table 2 Frequency statistics of the drug efficacy of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation（frequency ≥11）

2.1.4 高頻藥物藥性分析 見圖1。對高頻中藥進行四氣、五味、歸經(jīng)分析，結果表明四氣以溫（114 次）、微寒（67 次）、平（63 次）、寒（36 次）、微溫（14 次）為主，無涼性藥；五味以甘（179 次）、苦（177 次）、辛（112 次）、酸（44 次）、咸（31 次），微苦（12 次）為主，無淡味、澀味藥。歸經(jīng)以脾（204 次）、胃（172 次）為主，肺（98 次）和大腸（98 次）次之。

圖1 治療功能性便秘專利復方中藥高頻藥物的四氣（A）、五味（B）和歸經(jīng)（C）統(tǒng)計（頻數(shù)/次）Figure 1 Statistics of medicinal properties（A），flavours（B）and meridian tropism（C）of high-frequency drugs（frequency/time）of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

2.1.5 基于關聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析 當設置支持個數(shù)=9（支持度12.5%），置信度=0.9 時，置信度可以用來衡量關聯(lián)規(guī)則的可信程度的大小，獲得8 個常用藥物組合，見表3。核心組方為白術、當歸、肉蓯蓉、黃芪、甘草、厚樸、枳實，網(wǎng)絡展示見圖2。當置信度≥0.7 時，結果顯示多種藥物關聯(lián)規(guī)則，見表4。

圖2 治療功能性便秘專利中藥復方的核心藥物關系網(wǎng)絡Figure 2 The relationship network of core drugs of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

表3 治療功能性便秘專利中藥復方中高頻藥物組合Table 3 Combinations of high-frequency drugs in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

表4 治療功能性便秘專利中藥復方中藥物的關聯(lián)規(guī)則（置信度≥0.7）Table 4 Association rules of drug in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation（confidence ≥0.7）

2.1.6 聚類分析 見圖3、表5。設置聚類個數(shù)為4，將72 首專利復方聚類為4 類。

圖3 治療功能性便秘專利中藥復方方劑聚類分析圖Figure 3 Diagram of the cluster analysis of the patented Chinese herbal compounds

表5 治療功能性便秘專利中藥復方中的藥物聚類分析Table 5 Cluster analysis of drug in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

2.2 網(wǎng)絡藥理學分析結果

2.2.1 核心高頻藥物組相關靶點篩選 見表6。經(jīng)篩選、去重后共獲取到核心高頻藥物組（白術-當歸-肉蓯蓉）的14 個活性成分和190 個潛在靶點，規(guī)范化后最終得到潛在靶點163 個，涉及活性成分11 種。

2.2.2 核心高頻藥物組治療功能性便秘的潛在作用靶點預測 見圖4。將從4 個數(shù)據(jù)庫獲取的功能性便秘靶點整理去重后最終得到5 514 個，其中133 個靶點為核心高頻藥物組和功能性便秘的交集靶點。

圖4 核心高頻藥物組（白術-當歸-肉蓯蓉）-功能性便秘靶點的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of core high-frequency drug combination（Cistanches Herba-Angelicae Sinensis Radix-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）-functional constipation targets

2.2.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建 使用Cytoscape 3.8.0 軟件對133 個交集靶點進行中藥-活性成分-靶點圖的構建（圖5）并篩選出度值靠前的5 位活性成分（表7）。

圖5 高頻藥物組治療功能性便秘的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖Figure 5 Network diagram of “TCM-active comprnents-targets”of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

表7 度值排前5 位的活性成分Table 7 Active components with the top 5 of the degree value

2.2.4 核心高頻藥物組防治功能性便秘潛在靶點PPI網(wǎng)絡的構建 將交集靶點傳至STRING 數(shù)據(jù)庫得到PPI 網(wǎng)絡圖（圖6），通過Cytoscape 3.8.0 軟件分析DC、BC、EC、CC、NC 和LAC 拓撲參數(shù)，以6 個數(shù)值均大于其中位數(shù)的節(jié)點為條件，進行2 次篩選，得到蛋白激酶B1（AKT1）、熱休克蛋白90AA1（HSP90AA1）、 MYC、 缺 氧 誘 導 因 子1 亞 基α（HIF1A）、腫瘤抑制因子P53（TP53）和細胞周期蛋白1（CCND1）等6 個核心靶點（圖7）。

圖6 核心高頻藥物組防治功能性便秘潛在靶點的PPI 網(wǎng)絡模型Figure 6 Network model of PPI of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

圖7 核心高頻藥物組防治功能性便秘潛在靶點的PPI 網(wǎng)絡拓撲分析核心基因Figure 7 Topological analysis of core genes in PPI networks of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

2.2.5 交集靶點的通路富集分析 GO 富集分析得到2 181 個生物過程（BP）條目，主要包括對藥物反應、活性氧代謝過程、對化學壓力的反應等；72 個細胞組成（CC）條目，主要在膜筏、突觸后膜、突觸前膜等處發(fā)揮作用；172 個分子功能（MF）條目，主要富集在DNA-結合轉錄因子結合、核受體活性、配體-激活轉錄因子活性等，KEGG 富集分析得到磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、糖基化終產(chǎn)物（AGE）/糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-17、缺氧誘導因子（HIF）-1 等172 條通路。對排位靠前的條目進行繪圖，見圖8 和圖9。

圖8 核心高頻藥物組-功能性便秘的GO 基因功能富集分析（前10 位）Figure 8 GO enrichment analysis of the targets of the core highfrequency drug combination-functional constipation（top 10）

圖9 核心高頻藥物組-功能性便秘的KEGG 通路分析（前30 位）Figure 9 KEGG enrichment analysis of the core high-frequency drug combination-functional constipation（top 30）

2.2.6 核心化學成分與關鍵靶點的分子對接 將度值排前3 位的活性成分與“2.2.4”項下的核心靶點進行分子對接，結果顯示二者對接的最低結合能均≤-5 kcal·mol-1，可見結合活性較強[15]。并以功能性便秘臨床常用藥物莫沙必利（Mosapride）作為陽性對照藥物，對接結果見表8。槲皮素-HIF1A 和槲皮素-CCND1 的結合活性最強，PyMol 軟件展示見圖10。

圖10 部分活性成分和關鍵靶點分子對接圖Figure 10 Molecular docking diagram of some active components and key targets

表8 分子對接結果Table 8 Molecular docking results

3 討論

3.1 從高頻用藥、性味歸經(jīng)和功效統(tǒng)計方面分析用藥規(guī)律 在治療功能性便秘的72 個復方專利處方中，高頻藥物有白術、甘草、肉蓯蓉、枳實、當歸、火麻仁等20 味中藥，以補虛、理氣、清熱、瀉下、化濕、活血化瘀功效為主，這與便秘患者氣血陰陽虧虛、氣滯、熱結、濕阻、血瘀病機的認識一致[16-21]。白術在專利復方中出現(xiàn)的頻率最高，為健脾補氣要藥，其水溶性成分可以通過促進胃腸動力達到通便的效果[22-23]。肉蓯蓉的有效成分總寡糖能夠明顯升高5-羥色胺、血管活性腸肽、神經(jīng)降壓素，降低水通道蛋白3（AQP3），潤暢通便效果較好[24]。枳實可以通過增加Cajal 間質(zhì)細胞（ICC）中X 連鎖凋亡抑制蛋白、增殖細胞核抗原蛋白的表達促進ICC 的增殖，改善腸道運動功能障礙[25]。當歸有助于結腸黏膜萎縮的恢復，促進黏液分泌，增加糞便含水量，緩解便秘[26]?；鹇槿视湍苷{(diào)節(jié)腸內(nèi)短鏈脂肪酸（SCFAs）水平和腸道菌群改善便秘[27]。高頻藥物性味歸經(jīng)顯示性溫，味苦、甘、辛，歸屬脾、胃、肺、大腸四經(jīng)的藥物最多。溫藥具有溫中散寒、溫陽通脈、溫陽化氣等作用，既能散寒凝、血瘀之標實，又能溫陽助運以治其本。苦能泄，清泄火熱，泄降肺胃之氣逆，令氣機調(diào)達，腸腑暢通。甘能補、能和，補益氣血津液，恢復腸道濡養(yǎng)狀態(tài)。辛味能散能行，能開腠理、行氣滯、布津液發(fā)揮潤燥的作用，亦有“辛潤法”之稱[28]。

3.2 從關聯(lián)規(guī)則分析藥物配伍規(guī)律 關聯(lián)規(guī)則結果數(shù)值越大，說明其相關性高。綜合藥物頻次、支持度和置信度排位發(fā)現(xiàn)核心高頻藥物組是白術-肉蓯蓉-當歸。白術歸脾胃經(jīng)，善于益氣健脾、燥濕利水，肉蓯蓉歸腎、大腸經(jīng)，善于補腎陽、益精血，當歸歸肝、心、脾經(jīng)，為血中圣藥，善于補血活血、潤腸通便，三者配伍以補益為主，氣血互用，寓通于補，兼水濕、血瘀同治。核心組方包括白術、當歸、肉蓯蓉、黃芪、甘草、厚樸、枳實7 味藥物，可看做是枳術丸、當歸補血湯、小承氣湯、濟川煎等方劑的加減，臨床療效較佳[29-30]。其中關于枳術丸治療便秘的機制研究最多，其可能通過激活磷脂酶C-γ 信號通路、PI3K/AKT 信號、提高血清鈣離子的濃度、調(diào)節(jié)胃腸激素水平等促進胃腸運動[31-34]。

3.3 從藥物聚類分析處方核心組合 從聚類分析來看，可分為四類。第一類：菊花、決明子、馬齒莧、枸杞子、金銀花、甘草，以清熱解毒，潤腸通便為主。第二類：火麻仁、白芍、肉蓯蓉、甘草、白術、決明子，以芍藥甘草湯為基礎加減，酸甘化陰，滋養(yǎng)脾陰，白術益氣健脾，火麻仁、肉蓯蓉、決明子潤腸通便，以益氣養(yǎng)陰，潤腸通便為主。第三類：甘草、當歸、枳殼、肉蓯蓉、黨參、白術，可看做為四君子湯加減，以健脾助運，潤腸通便為主，兼行氣導滯。第四類：枳實、白術、玄參、麥冬、生地黃、甘草，為增液湯合枳術丸加減，既可行增水行舟使水滿舟行，又可健脾消痞使“四季脾旺不受邪”，以滋陰潤腸、運脾通便為主。

3.4 運用網(wǎng)絡藥理學分析核心高頻藥組可能的作用機制 基于數(shù)據(jù)挖掘研究結果，發(fā)現(xiàn)白術、肉蓯蓉、當歸是防治功能性便秘的高頻藥物，三藥不僅作為常用藥物組合出現(xiàn)，而且也在核心藥物關系網(wǎng)絡和聚類分析中列出，可見其為核心高頻藥組。白術-肉蓯蓉-當歸治療功能性便秘的主要活性成分可能為槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等。槲皮素能通過調(diào)節(jié)毒蕈堿乙酰膽堿受體下游信號、增加ICC 標志物（酪氨酸激酶受體和干細胞因子）以及降低AQP3 的水平緩解洛哌丁胺誘導的大鼠便秘[35-36]。β-谷甾醇具有改變小鼠腸道菌群結構并將其恢復到接近正常水平的潛力[37]。豆甾醇可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝物SCFAs 來恢復輔助性調(diào)節(jié)性T 細胞/T 細胞17（Treg/Th17）平衡以改善腸道炎癥[38]。

白術-肉蓯蓉-當歸治療功能性便秘的核心靶點有AKT1、HSP90AA1、MYC、HIF1A、TP53 和CCND1等。AKT1 是AKT 的一個亞型，通過調(diào)節(jié)AKT/核因子（NF）-κB 信號通路能夠促進慢傳輸型便秘（STC）小鼠排便、改善腸道流動性和增強ICC 增殖[39]。HSP90AA1 可以誘導結直腸癌細胞系的增殖、遷移和凋亡[40]。抑制c-Myc 介導的干擾素基因刺激因子活性，可以降低血清γ-干擾素（IFN-γ）和TNF-α 等炎性細胞因子的表達[41]。TNF-α 在小鼠結腸黏膜和肌層炎癥中發(fā)揮重要作用，并且TNF-α 可以通過作用于平滑肌直接誘導運動功能障礙[42]。HIF-1α 與腸道屏障的完整性和炎癥因子的轉錄調(diào)控有關[43]。IFN-γ以時間和劑量依賴性方式作用于NF-κB 通路提高HIF-1α 的表達，引發(fā)腸道屏障功能障礙和緊密連接蛋白破壞[44]。Tp53 通過唾液酸代謝在維持腸道微生物群共生和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關鍵作用，其突變導致的唾液酸代謝失調(diào)可能會引發(fā)腸道微生態(tài)失調(diào)導致慢性炎癥[45]。CCND1 可以調(diào)節(jié)細胞周期從G1 期到S 期的進程，位于蘇氨酸286 的突變體在調(diào)節(jié)炎癥和腫瘤發(fā)展中具有關鍵作用[46]。

KEGG 富集分析得到PI3K/Akt、AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1 等信號通路。洛哌丁胺誘導的SD 大鼠便秘與補體C3 及其受體下游PI3K/AKT、RAS 同源基因家族成員A（RhoA）/肌球蛋白輕鏈（MLC）、MAPK 信號通路的上調(diào)密切相關[47]。有研究[48]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路可以促進谷氨酸誘導的ICC 的凋亡、自噬和焦亡治療STC。有學者[49]認為AGE-RAGE 信號通路與腸道通透性有關，RAGE 可作為腸道屏障完整性的調(diào)節(jié)劑。AGE 和RAGE 水平升高可能導致糖尿病胃腸道功能障礙[50]。使用蛋白質(zhì)印跡法和聚合酶鏈反應測量STC 誘導的大鼠腸組織中MAPK 和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）表達，發(fā)現(xiàn)二者顯著升高[51]。阻斷MAPK/ERK 通路信號能夠改善胃腸動力障礙治療便秘[52]。IL-17A 通過上調(diào)肌層巨噬細胞中的一氧化氮合酶表達誘導腸道運動障礙[53]。

綜上所述，在治療功能性便秘的國家專利復方中，白術、甘草、肉蓯蓉、枳實、當歸等為高頻藥物，藥物功效以補虛藥、理氣藥、清熱藥、瀉下藥、化濕藥和活血化瘀藥為主，性味以甘溫為主，主歸脾、胃、肺和大腸經(jīng)。最常用的藥對為肉蓯蓉-當歸，核心高頻藥組是肉蓯蓉-當歸-白術，核心處方組成為白術、當歸、肉蓯蓉、黃芪、甘草、厚樸、枳實。核心高頻藥組肉蓯蓉-當歸-白術可能通過槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分，調(diào)節(jié)AKT1、HSP90AA1、MYC、HIF1A、TP53 和CCND1等核心靶點，調(diào)控PI3K/Akt、AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1 等信號通路發(fā)揮恢復腸道動力、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制炎癥反應等作用治療功能性便秘。本研究基于中國專利數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法挖掘防治功能性便秘的國家專利復方的潛在用藥規(guī)律及作用機制，后續(xù)仍需結合臨床實踐，進行相應的實驗研究和臨床驗證，為其臨床有效防治功能性便秘提供更準確的證據(jù)。