葛文靜，單朋濤，2，李兵杰，2，王慧森，劉明，李華妮，李更生，梁瑞峰，2 [. 河南省中醫(yī)藥研究院（河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院），河南 鄭州 450004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046]

中醫(yī)理論認為，在方劑配伍中通過運用引經(jīng)藥可改變其他藥物的作用方向，使其作用側(cè)重或集中于特定的部位，引導(dǎo)藥物直達經(jīng)絡(luò)臟腑，使藥效靶向集中。引經(jīng)藥的使用，是中醫(yī)遣方用藥的一大特色，極大地豐富了方劑配伍的內(nèi)容?，F(xiàn)代研究[1-2]表明，引經(jīng)藥可增強中藥療效，若引經(jīng)藥使用得當，能起到事半功倍的作用，對臨床用藥具有重要意義。

補中益氣湯出自李東垣的《脾胃論》，為治療脾胃氣虛的經(jīng)典方劑，方中升麻、柴胡升陽舉陷，升麻引陽明清氣上升，柴胡引少陽清氣上升，在方中發(fā)揮脾經(jīng)引經(jīng)作用。中醫(yī)認為脾主運化，司中氣，與胃同為氣血生化之源，脾胃虛弱，運化失司，可因水谷精微吸收不足，以致氣血生化之源匱乏。臨床和基礎(chǔ)研究均顯示，脾虛患者消化功能紊亂，免疫功能低下[3-4]。因此，本研究擬通過脾虛泄瀉大鼠模型，觀察補中益氣湯加減引經(jīng)藥升麻、柴胡后，對脾虛泄瀉大鼠胃腸功能、免疫紊亂和腸黏膜的影響，以期闡明升麻、柴胡的引經(jīng)增效作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，6～8 周，體質(zhì)量（200 ± 20）g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003，動物質(zhì)量合格證號：0002478。飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥研究院SPF 級實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度：20～22 ℃，濕度：45%～55%，12 h 光暗循環(huán)周期。實驗經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準，批準號：HNTCMDW-20200306。

1.2 藥物及試劑 黃芪、炙甘草、人參、當歸、陳皮、白術(shù)、升麻、柴胡購于河南省順康醫(yī)藥有限公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院王慧森副研究員鑒定，均符合2020 年版《中華人民共和國藥典》項下規(guī)定；利血平注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1903211；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22；胃泌素（gastrin，GAS）試劑盒，武漢華美生物公司，批號：Y13035081；大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）ELISA 試劑盒，武漢伊萊瑞特生物公司， 批號分別為： GY02VFJN5336、ERSH5RSLJC、V26VVA4LFA；CD3+、CD4+、CD8+一抗，美國Biolegend 公司，批號分別為：B247807、B201139、B263802；p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）一抗，武漢三鷹公司，批號分別為：14064-1-AP、28796-1-AP；閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）一抗，美國Affinity 公司，批號分別為：44h7470、53t8241。

1.3 儀器 2K15 型冷凍離心機，德國Sigma 公司；Synergy NEO 型全功能酶標儀，美國Bio-Tek 公司；IX73 型顯微鏡，日本Olympus 公司；Fluorchem R 型成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech 公司；NAVIOS 流式細胞儀，美國Beckman Coulter 公司；R500 型小動物麻醉機，深圳瑞沃德生命科技有限公司；DYCZ-24DN 型電泳儀、DYCZ-40D 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.4 藥物制備 大黃提取液[5]：稱取大黃500 g，取10 倍量70%乙醇，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，減壓回收乙醇，調(diào)整濃度為相當于含生藥1.5 g·mL-1。補中益氣湯提取液：按原方比例稱取適量藥材加10 倍量水，浸泡30 min 后煎煮2 h，提取2 次，合并濾液，調(diào)整濃度為含生藥1.323 g·mL-1。補中益氣湯缺升麻、柴胡組提取液制備方法同上，調(diào)整質(zhì)量濃度為補中益氣湯缺升麻組（含生藥1.197 g·mL-1）、補中益氣湯缺柴胡組（含生藥1.197 g·mL-1）和補中益氣湯缺升麻柴胡組（含生藥1.071 g·mL-1），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 模型復(fù)制及給藥 雄性SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、補中益氣湯全方組（含生藥13.23 g·kg-1）、補中益氣湯缺升麻組（含生藥11.97 g·kg-1）、補中益氣湯缺柴胡組（含生藥11.97 g·kg-1）和補中益氣湯缺升麻柴胡組（含生藥10.71 g·kg-1），每組10 只。采用“利血平+大黃+隔日進食”多因素法復(fù)制脾虛泄瀉大鼠模型[6]，方法如下：大鼠灌胃大黃提取液（15 g·kg-1），每日1 次；皮下注射利血平（0.5 mg·kg-1），隔日1 次；隔日禁食，與利血平交替進行。正常大鼠每日灌胃蒸餾水、皮下注射等體積生理鹽水，共14 d。大鼠出現(xiàn)精神萎靡、攝食量減少、毛發(fā)枯黃、瞇眼懶動、扎堆弓背、大便稀溏、肛周污穢、體質(zhì)量降低等癥狀，提示模型復(fù)制成功。從第3 周開始，每日上午灌胃給藥，下午給予大黃提取液（15 g·kg-1），每日1 次，連續(xù)14 d，正常組和模型組的大鼠灌服等體積蒸餾水。

1.6 一般狀態(tài)觀察及腹瀉指數(shù)的測定 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活躍程度、皮膚毛發(fā)、飲食狀態(tài)、大便狀態(tài)等變化。給藥前、末次給藥后將各組的每只大鼠分別置于代謝籠中，籠下放置濾紙，統(tǒng)計4 h 內(nèi)濾紙上所有糞便總數(shù)、稀便數(shù)，計算各組大鼠腹瀉指數(shù)[6]。稀便率：稀便次數(shù)與總便次數(shù)之比。稀便級：以稀便污跡的直徑進行定級，分為4 級：1 級（＜1 cm）、2 級（1～2 cm）、3 級（2～3 cm）、4 級（＞3 cm）。逐一統(tǒng)計每堆稀便的級數(shù)，然后將該鼠所有稀便級數(shù)相加后除以稀便次數(shù)，得到平均稀便級。計算腹瀉指數(shù)：腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級。

1.7 脾臟及胸腺指數(shù) 末次給藥后禁食不禁水24 h，2.5%異氟烷1 L·min-1吸入麻醉，腹主動脈取血，900×g離心10 min 分離血清，-80 ℃保存。取一部分空腸置于4%多聚甲醛固定，另一部分-80 ℃保存。分離各組大鼠的脾臟和胸腺，去除附帶脂肪組織，用濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，計算脾臟及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.8 空腸組織病理學(xué)的觀察 空腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色后于顯微鏡下觀察各組大鼠空腸組織的病理學(xué)改變。

1.9 血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 的測定 麻醉后腹主動脈取血，900×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 均用ELISA 試劑盒測定，按試劑盒說明書進行操作。

1.10 血液中T 淋巴細胞亞群的測定 取3 mL 血于抗凝管中，按流式抗體說明書進行處理，采用流式細胞儀進行T 淋巴細胞CD3+、CD4+、CD8+亞群的檢測，計數(shù)CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞的百分比和CD4+/CD8+T 淋巴細胞的比值。

1.11 空腸組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表達 取適量空腸組織，加入RIPA裂解液冰上裂解提取組織蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，100 ℃變性5 min 后取等量蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄封閉液后漂洗3 次，分別加入p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶2 000）、ZO-1（1∶2 000）、Occludin（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜，羊抗鼠二抗（1∶10 000）室溫下震蕩孵育1 h，洗膜后加入ECL 顯色液曝光拍照，ImageJ 軟件分析灰度值，以目的條帶/GAPDH 灰度值計算蛋白相對表達量。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 26.0 軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠一般狀態(tài)的影響 正常組大鼠活動情況及精神狀態(tài)良好，毛發(fā)白亮有光澤，攝食量正常，大便橢圓顆粒狀，無腹瀉。模型組大鼠精神萎靡、瞇眼拱背、扎堆蜷縮、攝食量及活動減少、毛發(fā)枯黃、大便稀溏，肛周污穢。不同配伍補中益氣湯藥物組大鼠較模型組大鼠精神狀態(tài)均有改善，毛發(fā)有光澤，攝食量增加，大便基本成形。

2.2 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響 結(jié)果見表1。正常組大鼠給藥前后均無腹瀉。給藥前，模型組與補中益氣湯各藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，與模型組比較，補中益氣湯全方組和補中益氣湯缺柴胡組大鼠腹瀉指數(shù)均不同程度降低（P＜0.01，P＜0.05）。與補中益氣湯全方組比較，補中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠腹瀉指數(shù)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明其療效不如補中益氣湯全方組。

表1 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

表1 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補中益氣湯全方組比較，△P＜0.05

給藥后0 1.02±0.19**0.72±0.13##0.86±0.23 0.83±0.16#0.92±0.18△組別正常組模型組補中益氣湯全方組補中益氣湯缺升麻組補中益氣湯缺柴胡組補中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71給藥前0 1.03±0.20**1.02±0.17 1.00±0.18 0.99±0.22 1.02±0.23

2.3 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，不同配伍補中益氣湯藥物組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與補中益氣湯全方組比較，補中益氣湯缺升麻、補中益氣湯缺柴胡、補中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均不同程度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）

表2 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表2 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

胸腺指數(shù)/（mg·g-1）1.56±0.15 1.22±0.15**1.52±0.11##1.42±0.22#1.45±0.21#1.40±0.26#組別正常組模型組補中益氣湯全方組補中益氣湯缺升麻組補中益氣湯缺柴胡組補中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71脾臟指數(shù)/（mg·g-1）2.62±0.28 2.22±0.21**2.60±0.21##2.54±0.17##2.52±0.20##2.45±0.24#

2.4 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠空腸組織病理形態(tài)的影響 結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠空腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰、完整，絨毛形態(tài)規(guī)則，固有層未見炎性細胞浸潤。脾虛泄瀉模型組大鼠空腸絨毛變形、彎曲、萎縮，空腸黏膜損傷明顯，部分上皮細胞缺失，固有層可見大量炎癥細胞浸潤，腺體排列紊亂。不同配伍補中益氣湯藥物組大鼠空腸黏膜損傷較模型組可見不同程度改善，炎癥細胞浸潤減少，腺體排列較整齊。與缺升麻、柴胡的各組比較，補中益氣湯全方組改善更為明顯。

圖1 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠空腸組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the pathological morphology of jejunum tissue in splenasthenic diarrhea rats（HE staining，×200）

2.5 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 水平的影響 結(jié)果見表3。模型組大鼠血清中IL-6 水平較正常組明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，不同配伍補中益氣湯組血清中IL-6 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），但補中益氣湯全方組降低更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，補中益氣湯全方組大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均不同程度升高（P＜0.01）。與補中益氣湯全方組比較，補中益氣湯缺升麻組、補中益氣湯缺柴胡組、補中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠血清中GAS、VIP 的水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），說明補中益氣湯全方組療效更佳。

表3 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表3 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

VIP/（pg·mL-1）198.23±29.60 130.67±15.02**187.11±27.61##154.84±20.70#△△165.95±15.23##△144.84±16.49△△組別正常組模型組補中益氣湯全方組補中益氣湯缺升麻組補中益氣湯缺柴胡組補中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 IL-6/（pg·mL-1）35.13±4.34 52.45±6.10**37.43±4.19##42.60±4.81##△40.61±4.35##46.88±5.85#△△IL-10/（pg·mL-1）28.58±4.70 21.01±3.43**27.48±4.45##24.34±3.29 24.51±2.77#23.40±3.52△GAS/（ng·mL-1）2.53±0.35 0.98±0.15**1.56±0.24##1.32±0.22##△1.13±0.22△△1.02±0.19△△

2.6 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血液中T淋巴細胞亞群的影響 結(jié)果見圖2、表4。T 淋巴細胞亞群流式結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值降低（P＜0.01）。與模型組比較，補中益氣湯全方組大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值均有所升高（P＜0.01），且較補中益氣湯缺升麻柴胡組升高更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，各組大鼠外周血CD8+T 淋巴細胞百分比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細胞亞群影響的流式細胞儀檢測結(jié)果Figure 2 Results of flow cytometry of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats

表4 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細胞亞群的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表4 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細胞亞群的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

CD4+/CD8+2.71±0.54 1.88±0.28**2.46±0.41##2.04±0.22△2.23±0.43#2.08±0.34△組別正常組模型組補中益氣湯全方組補中益氣湯缺升麻組補中益氣湯缺柴胡組補中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 CD3+/%56.14±4.30 39.46±6.55**53.42±4.36##51.91±5.07##47.45±5.31##△44.34±5.93#△△CD4+/%41.03±4.29 25.75±4.15**38.01±2.91##34.95±3.93##32.62±2.58##△△29.82±3.23#△△CD8+/%15.50±2.45 13.89±2.92 15.73±2.52 17.28±1.89##15.16±3.34 14.71±3.07

2.7 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達的影響 結(jié)果見圖3、表5。與正常組比較，模型組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白表達水平升高（P＜0.01），ZO-1、Occludin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，補中益氣湯全方組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白水平降低， ZO-1、Occludin 蛋白表達水平增加（P＜0.01）。與補中益氣湯全方組比較，補中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白表達水平升高，ZO-1、Occludin蛋白水平降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠空腸組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表達Figure 3 The protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of rats of each group

表5 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

表5 補中益氣湯加減引經(jīng)藥對脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

Occludin 0.74±0.12 0.37±0.06**0.70±0.10##0.49±0.05#△△0.64±0.09##0.41±0.07△△組別正常組模型組補中益氣湯全方組補中益氣湯缺升麻組補中益氣湯缺柴胡組補中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 p38 MAPK 0.56±0.06 0.56±0.04 0.58±0.06 0.53±0.06 0.57±0.07 0.57±0.07 p-p38 MAPK 0.23±0.03 0.44±0.06**0.28±0.03##0.35±0.05##△0.33±0.04##0.39±0.04#△△ZO-1 0.66±0.10 0.34±0.04**0.56±0.06##0.42±0.05#△△0.39±0.04△△0.45±0.05##△△

3 討論

中醫(yī)理論認為，在方劑配伍中運用引經(jīng)藥可引導(dǎo)藥物直達經(jīng)絡(luò)臟腑，使藥效靶向集中，從而提高療效[7]。補中益氣湯是治療脾胃氣虛的代表方，方中升麻、柴胡升陽舉陷，協(xié)助君藥升提下陷之中氣，《本草綱目》：“升麻引陽明清氣上升，柴胡引少陽清氣上行，此乃稟賦虛弱，元氣虛餒，及勞役饑飽，生冷內(nèi)傷，脾胃引經(jīng)最要藥也”，在方中共為引經(jīng)佐使藥。中醫(yī)認為脾主運化，脾胃虛弱、脾失健運可導(dǎo)致腹脹、泄瀉等腸道功能紊亂癥狀。本研究采用“大黃+利血平+隔日進食”多因素法復(fù)制脾虛泄瀉大鼠模型，模型大鼠出現(xiàn)大便溏稀、精神萎靡、瞇眼拱背、扎堆蜷縮等與臨床脾虛證相似的癥狀，且模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 等指標均與正常大鼠有明顯性差異，表明脾虛泄瀉大鼠模型復(fù)制成功。不同配伍的補中益氣湯均可改善脾虛泄瀉大鼠的癥狀，以補中益氣湯全方組效果最為明顯，補中益氣湯缺柴胡組次之，表明升麻、柴胡對補中益氣湯具有引經(jīng)增效作用，且升麻的引經(jīng)增效作用優(yōu)于柴胡。

中醫(yī)認為脾主運化，其功能主要與胃腸運動、胃腸激素分泌等密切相關(guān)，脾胃虛弱可導(dǎo)致機體消化功能紊亂[8]。GAS 作為調(diào)節(jié)胃腸運動的激素，具有調(diào)節(jié)吸收、轉(zhuǎn)運及代謝等生理活性，可加強胃腸運動和膽囊收縮，促進胃蛋白酶原、胃酸、膽汁的分泌，是衡量胃腸功能的重要指標[9-10]。VIP 是由腸道神經(jīng)元分泌的調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)與胃腸運動的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可通過松弛胃腸平滑肌，抑制結(jié)腸和直腸緊張性及小腸運動。VIP 水平異?？芍挛改c動力和分泌功能紊亂，導(dǎo)致腸道平滑肌運動障礙，引起腹瀉[11-12]。有研究[13]表明，多因素誘導(dǎo)的脾虛大鼠模型在造模第2 周時血漿中VIP 水平較正常大鼠增高，第3 周后VIP 水平較正常大鼠降低，而GAS 水平在整個造模期間均低于正常大鼠。在造模的不同時間點各種胃腸激素水平會發(fā)生不同的變化，導(dǎo)致胃腸運動無節(jié)律、消化液分泌紊亂，嚴重影響到胃腸的消化吸收功能，引起胃腸功能紊亂。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腹瀉指數(shù)高于正常組，血清GAS、VIP 水平均明顯低于正常組，補中益氣湯各給藥組大鼠腹瀉指數(shù)降低，GAS、VIP 水平均有不同程度升高，胃腸功能紊亂有所改善，其中補中益氣湯全方組療效更明顯，提示升麻、柴胡作為引經(jīng)藥可能通過調(diào)控胃腸激素的分泌調(diào)節(jié)胃腸功能而發(fā)揮增效作用。

脾與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，中醫(yī)認為脾居中焦，為氣血生化之源，氣機升降之樞紐，是人體抗御病邪的重要防衛(wèi)機構(gòu)[8]。胸腺是T 細胞分化、成熟的器官，脾臟是成熟T 細胞等定居和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所，二者是機體最重要的免疫器官。脾臟及胸腺指數(shù)的改變可直觀反映機體及細胞免疫水平的變化[14-15]。T 淋巴細胞亞群是監(jiān)測機體細胞免疫功能的重要指標，CD3+T 細胞是體內(nèi)的T 淋巴細胞總和，存在于外周血T 淋巴細胞和胸腺細胞表面，參與機體抗原應(yīng)激反應(yīng)。CD4+T 淋巴細胞主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制免疫細胞的活化。CD8+T 細胞主要是一類具有殺傷活性的效應(yīng)細胞，能直接識別靶細胞，發(fā)揮免疫效應(yīng)。CD4+與CD8+T 淋巴細胞，兩者相互協(xié)作共同發(fā)生作用，CD4+/CD8+比值變化比較敏感，可及時反映機體當前的免疫狀態(tài)[16-18]。IL-6 作為機體炎癥反應(yīng)最早出現(xiàn)的細胞因子，主要由活化的巨噬細胞、淋巴細胞產(chǎn)生，在腸道炎癥中，IL-6 的過度表達會影響腸上皮細胞的電解質(zhì)分泌，使腸黏膜通透性增加，IL-10 主要由CD4+Th2 輔助細胞亞群產(chǎn)生，是細胞免疫反應(yīng)的抑炎癥因子[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛泄瀉大鼠血清中CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值較正常組明顯下降，IL-6 水平升高，IL-10 含量降低，表明脾虛可使機體免疫功能降低；不同配伍補中益氣湯可提高脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺指數(shù)，提高CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞百分比，恢復(fù)T 淋巴細胞CD4+/CD8+的平衡，降低IL-6 水平，升高IL-10 含量，補中益氣湯全方組改善更明顯，提示升麻、柴胡對補中益氣湯提高免疫功能有引經(jīng)增效作用。

脾虛泄瀉可引起炎癥反應(yīng)，造成腸黏膜屏障破壞，進而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。研究[21-22]表明，腸道細胞間的緊密連接是構(gòu)成腸道屏障的重要組成部分，是調(diào)節(jié)腸黏膜通透性的關(guān)鍵因素。ZO-1、Occludin 蛋白作為緊密連接的重要組成蛋白，對維持腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整、功能正常及調(diào)節(jié)腸道通透性發(fā)揮著重要作用。ZO-1 還作為橋梁蛋白，可將Occludin 蛋白的末端與細胞骨架蛋白連接起來，維持緊密連接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23-24]。研究[25]表明，ZO-1 蛋白表達減少，將導(dǎo)致其他緊密連接蛋白的表達下調(diào)，使得緊密連接結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，腸黏膜屏障功能破壞。Occludin蛋白的缺乏，會導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙，使腸道通透性增加，引起腹瀉[26]。p38 MAPK 是MAPK 家族成員之一，可以介導(dǎo)應(yīng)激、炎癥等細胞反應(yīng)。p38 MAPK 磷酸化為p-p38 MAPK 后激活，可調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，促進IL-6、TNF-α 等細胞因子的分泌，引起腸黏膜炎癥反應(yīng)。同時，p38 MAPK 信號通路激活可抑制ZO-1、Occludin 等蛋白的表達，導(dǎo)致腸道緊密連接結(jié)構(gòu)破壞[27-29]。本研究結(jié)果顯示：脾虛泄瀉模型組大鼠空腸組織病理學(xué)觀察可見絨毛彎曲、變形、萎縮，空腸黏膜損傷，部分上皮缺失，固有層可見大量炎癥細胞浸潤，組織內(nèi)p-p38 MAPK 蛋白表達增加，ZO-1 和Occludin 蛋白表達減少；與模型組比較，不同配伍補中益氣湯藥物組能明顯降低p-p38 MAPK 蛋白的表達，提高大鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達；補中益氣湯缺柴胡組p-p38 MAPK、Occludin 蛋白表達與全方組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示升麻、柴胡作為引經(jīng)藥可能通過調(diào)節(jié)空腸黏膜屏障蛋白的表達，降低空腸組織通透性發(fā)揮引經(jīng)增效作用，且升麻的引經(jīng)增效作用優(yōu)于柴胡。

綜上所述，補中益氣湯可明顯改善脾虛泄瀉，方中升麻、柴胡可增強補中益氣湯的藥效，其機制可能與調(diào)節(jié)胃腸功能、恢復(fù)免疫功能紊亂及上調(diào)空腸緊密連接蛋白表達有關(guān)?，F(xiàn)代實驗研究[7，30]表明引經(jīng)藥可能通過提高靶組織中的藥物分布發(fā)揮引經(jīng)作用，升麻、柴胡作為引經(jīng)藥在補中益氣湯中具有增強療效的作用，但其是否通過增加有效成分在相關(guān)組織的分布發(fā)揮引經(jīng)作用尚需進一步研究。