呂娟，張云霞，白俊嫄，蒲曉薇，戴恩來（.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

腎小球足細胞作為終末分化的上皮細胞，覆蓋于腎小球毛細血管外表面，與腎小球基底膜和腎小球內(nèi)皮細胞一起形成腎小球濾過屏障。足細胞功能障礙或損傷引起腎小球濾過屏障功能受損，出現(xiàn)蛋白尿，是導致腎病綜合征的重要原因[1-3]。

自噬機制已被確定為將受損蛋白質(zhì)和細胞器輸送到溶酶體以維持細胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑，足細胞關鍵自噬蛋白缺失導致蛋白尿，誘導自噬是防止足細胞衰老和腎小球損傷的主要保護機制[4]。足細胞高水平的自噬可減輕足細胞損傷[5-6]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR）被認為是自噬和細胞代謝的關鍵調(diào)控因子[7]。mTOR 激活足細胞自噬，從而減少足細胞的凋亡[8]。研究[9-10]表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在腎組織調(diào)節(jié)自噬中發(fā)揮著不可或缺的作用。同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）可通過激活脂質(zhì)磷酸酶使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈级姿岫Щ睿撔哉{(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，增強自噬[11-12]。

課題組前期體內(nèi)研究[13]已證實，淫羊藿苷聯(lián)合激素可以有效保護阿霉素腎病綜合征足細胞的損傷，延緩病理進程。本研究旨在從細胞層面，基于PTEN/PI3K/Akt/mTOR 信號通路，探討淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松對阿霉素誘導的足細胞損傷模型大鼠足細胞自噬水平的影響，以揭示其對足細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 大鼠腎足細胞株（Rat podocyte），編號：338697，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.2 藥物及試劑 鹽酸阿霉素（批號：427D022）、淫羊藿苷（批號：1128F021）、地塞米松（批號：320E056），均購自北京索萊寶科技有限公司；氯喹，批號：C843545，購自上海麥克林生化科技股份有限公司；synaptopodin 抗體（批號：224491）、LC3-Ⅱ抗體（批號：192890）、PETN 抗體（批號：32199）、mTOR 抗體（批號：32028）、PI3K 抗體（批號：151549）、p62抗體（批號：ab109012）、GAPDH 抗體（批號：37168）、山羊抗兔IgG（批號：150182），均購自英國Abcam 公司；Akt 抗體，批號：128414，美國GeneTex公司；HBAD-mRFP-GFP-LC3 腺病毒，貨號：HB-AP210 0001，上海漢恒生物科技有限公司；胎牛血清，批號：504110916，上海元升生物科技有限公司；RIPA 裂解液，批號：20180913，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，美國AIRTHCH 公司；FV1000 型共聚焦顯微鏡，日本Olympus 公司；ICX41 型倒置熒光顯微鏡，浙江舜宇光學股份有限公司；HT7700 型透射電鏡，韓國COXEM 公司；DYCZ-40G 型轉(zhuǎn)膜儀、DYCZ-25D 型電泳儀，均購自北京六一生物科技公司；5424R 型低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司。

1.4 模型的建立、分組及給藥 將大鼠足細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察足細胞生長情況，取分化成熟、對數(shù)生長期的細胞進行實驗。根據(jù)前期預實驗的結(jié)果，采用2 μmol·L-1阿霉素干預足細胞24 h 建立阿霉素足細胞損傷模型。地塞米松、淫羊藿苷、氯喹給藥劑量均為10 μmol·L-1。將實驗分為4 組：空白組、模型組（阿霉素2 μmol·L-1）、淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組（阿霉素2 μmol·L-1+淫羊藿苷10 μmol·L-1+地塞米松10 μmol·L-1）、氯喹組（阿霉素2 μmol·L-1+淫羊藿苷10 μmol·L-1+地塞米松10 μmol·L-1+氯喹10 μmol·L-1）。氯喹組預先加入氯喹處理1 h，阿霉素與治療藥物（淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松）同時加入，作用24 h 后檢測相關指標。

1.5 免疫熒光法檢測synaptopodin 的表達 收集足細胞， PBS 漂洗，4%多聚甲醛固定，加synaptopodin一抗，過夜；PBS 洗滌3 次，加二抗，孵育1 h。加DAPI 染液，37 ℃孵育，防熒光淬滅劑封片，拍照分析處理。觀察各組synaptopodin 的表達水平。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察足細胞的自噬流水平 將生長狀態(tài)良好的大鼠足細胞接種到6 孔板，待細胞融合程度達到70%時，加入自噬雙標腺病毒mRFPGFP-LC3；感染24 h， PBS 洗2～3 次；加4%多聚甲醛，固定30 min；PBS 漂洗3 次；DAPI 避光染色，室溫靜置15 min；PBS 漂洗3 次，封片、拍照分析。觀察足細胞內(nèi)GFP 和RFP 熒光信號，判斷足細胞內(nèi)自噬流水平的變化。

1.7 透射電鏡觀察足細胞內(nèi)自噬體及自噬溶酶體變化 收集足細胞，加5%戊二醛室溫固定3 h；加1%鋨酸固定，PBS 洗滌3 次，依次用50%、70%、90%乙醇脫水各20 min，90%乙醇+90%丙酮（1∶1）脫水20 min，90%、100%丙酮脫水各20 min，丙酮脫水20 min，重復3 次；室溫下依次采用純丙酮+包埋液（2∶1）處理4 h，純丙酮+包埋液（1∶1）過夜，純包埋液37 ℃處理3 h；依次37 ℃烘箱內(nèi)過夜，45 ℃烘箱內(nèi)12 h，60 ℃烘箱內(nèi)24 h；超薄切片機切片，每片厚度50 nm；透射電鏡觀察足細胞自噬體及自噬溶酶體并拍攝照片。

1.8 Western Blot 法檢測LC3-Ⅱ、p62 和PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的蛋白表達 收集足細胞，提取總蛋白，加入相應劑量RIPA 裂解液，以離心半徑8 cm，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液。根據(jù)BCA 試劑盒說明書，計算各組足細胞蛋白濃度。配置好濃縮膠及分離膠后，電泳轉(zhuǎn)膜。封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗滌后放入二抗工作液中，置于搖床1 h。漂洗后加入發(fā)光液，成像儀曝光。采用ImageJ 軟件分析灰度值，觀察自噬相關蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料結(jié)果以均數(shù)± 標準差（±s）表示。符合正態(tài)性要求采用單因素方差分析組間差異，方差齊時兩兩比較用LSD 法，方差不齊時則采用Grames-Howell 法進行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠足細胞synaptopodin 表達的影響 見圖 1、圖2。與空白組比，模型組大鼠足細胞synaptopodin 的表達量下降（P＜0.01）；與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組足細胞synaptopodin 的表達量增加（P＜0.05）；與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組足細胞synaptopodin 的表達量下降（P＜0.05）。

圖1 大鼠足細胞synaptopodin 蛋白表達的免疫熒光染色圖（×400）Figure 1 Immunofluorescence staining results of synaptophodin protein expression in rat podocytes（×400）

圖2 大鼠足細胞synaptopodin 蛋白的相對表達量（±s，n=3）Figure 2 Relative expression of synaptophodin protein in rat podocytes（±s，n=3）

2.2 對腺病毒mRFP-GFP-LC3 轉(zhuǎn)染足細胞自噬的影響 見圖3、圖4。自噬體與溶酶體結(jié)合后形成自噬溶酶體，自噬溶酶體由于溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，可以導致pH 下降，GFP 淬滅。而mRFP 是穩(wěn)定的熒光表達基團，不受外界影響。顯微鏡下成像后紅色的斑點指示自噬溶酶體，紅綠熒光Merge 后出現(xiàn)的黃色斑點即是自噬體?？瞻捉M足細胞中可見紅色斑點和黃色斑點表達，自噬水平正常。與空白組比，模型組紅色斑點和黃色斑點明顯減少（P＜0.01），自噬流減弱。與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組紅色斑點和黃色斑點明顯增加（P＜0.01），自噬流增強。與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組紅色斑點明顯減少（P＜0.01），黃色的斑點增加（P＜0.05），自噬流被抑制。

圖3 大鼠足細胞中自噬流的變化（×400）Figure 3 Changes of autophagic flow in rat podocytes（×400）

圖4 共聚焦顯微鏡下大鼠足細胞中自噬體及自噬溶酶體的比較（±s，n=3）Figure 4 Comparison of autophagosomes and autophagic lysosomes in rat podocytes under confocal microscope（± s，n=3）

2.3 對足細胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的影響 見圖5。透射電鏡下吞噬泡形狀為新月形或杯形，雙層或多層膜，具有包繞胞漿中組織成分的趨勢；自噬小體具有雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含胞漿組織成分，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等；自噬溶酶體為單層膜，液泡狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的胞漿細胞器成分已降解，其內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，輪廓不清晰?？瞻捉M見自噬體2 個，自噬溶酶體4 個；模型組只見1 個自噬溶酶體；淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組見自噬體1 個，自噬溶酶體2 個；氯喹組見自噬體3 個，自噬溶酶體1 個。

圖5 透射電鏡下大鼠足細胞中自噬體及自噬溶酶體的變化（×15 000）Figure 5 Changes of autophagosome and autophagic lysosome in rat podocytes under transmission electron microscope（×15 000）

2.4 對LC3-Ⅱ、p62 和PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達的影響 見圖6、圖7。與空白組比，模型組LC3-Ⅱ、PTEN 的表達減少，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達增加（P＜0.01）。與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組LC3-Ⅱ、PTEN的表達量增加（P＜0.01），p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達減少（P＜0.01）。與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組LC3-Ⅱ和p62 的表達量均升高（P＜0.05，P＜0.01），PTEN、p-PI3K、p-Akt、pmTOR 的表達量均未見明顯變化（P＞0.05）。

圖6 Western Blot 法檢測各組LC3-Ⅱ、p62、PTEN、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達Figure 6 Protein expressions of LC3-Ⅱ，p62，PTEN，p-mTOR，p-PI3K，p-Akt detected by Western Blot

圖7 各組LC3-Ⅱ、p62、PTEN、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達量的比較（±s，n=3）Figure 7 Comparison of the protein expressions of LC3-Ⅱ，p62，PTEN，p-mTOR，p-PI3K and p-Akt among each group（±s，n=3）

3 討論

阿霉素是一種腎毒素，誘導的足細胞損傷表現(xiàn)為足細胞通透性增加，細胞骨架破壞，凋亡增加。阿霉素損傷導致的足細胞足突消失，代表了臨床腎病綜合征的特征[14-16]。地塞米松能夠增加足細胞肌動蛋白絲的穩(wěn)定性[17]。淫羊藿苷可降低足細胞凋亡、維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，在保護足細胞損傷中具有潛在的作用[18]。自噬激活對足細胞處理各種應激至關重要，可以保護細胞免受多種有害應激而引起的凋亡，維持足細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]。課題組前期研究[20]已證實淫羊藿苷可以提高激素的敏感性，增加治療阿霉素腎病綜合征的有效性。動物實驗也已證實淫羊藿苷聯(lián)合激素使用效果優(yōu)于單獨使用[21]，但其有效性的具體作用機制尚不明確。本研究進一步探討了其聯(lián)合使用的作用機制。

足細胞是腎小球基底膜最外層的上皮細胞，由胞體和足突組成，兩相鄰足突之間的裂隙稱為裂孔，其上覆有一層拉鏈狀蛋白結(jié)構(gòu)——裂孔隔膜，為足細胞特有的細胞間連接，在維持腎小球濾過屏障的完整性方面起著關鍵作用[22]。Synaptopodin 是一種富含脯氨酸的肌動蛋白結(jié)合蛋白，存在于分化足細胞的足突中[23]。Synaptopodin 結(jié)構(gòu)突變或表達缺失導致足細胞裂孔隔膜疏松、穩(wěn)定性下降，蛋白尿發(fā)生[24-25]。

本研究結(jié)果表明，阿霉素可以降低足細胞synaptopodin 的表達，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松可以有效地增加synaptopodin 的表達，發(fā)揮足細胞的保護作用；加入自噬抑制劑后，synaptopodin 的表達被明顯地抑制。

自噬相關蛋白LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集。無自噬時，LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜。但是LC3 升高增多并不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻。因此為了鑒定真正自噬水平高低，可以進一步鑒定與LC3 相互作用的蛋白p62。p62 能調(diào)節(jié)自噬并與LC3 相互結(jié)合[26]。p62 和LC3 最終被自噬溶酶體內(nèi)的溶酶體降解[27]。因此當自噬溶酶體降解途徑受阻時，體內(nèi)LC3、p62 均升高。氯喹作為經(jīng)典的自噬抑制劑，通過改變?nèi)苊阁w的酸性環(huán)境阻斷自噬體與溶酶體的結(jié)合，使得大量的待降解蛋白在細胞中堆積。氯喹的親溶酶體性使其進入細胞后特異性地作用于溶酶體，這導致溶酶體內(nèi)pH 升高，喪失了與自噬體結(jié)合的能力，發(fā)揮對自噬的抑制作用[28]。

本文的激光共聚焦研究結(jié)果表明，阿霉素可以明顯降低足細胞內(nèi)自噬流水平，自噬體及自噬溶酶體均降低。淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松可增加足細胞自噬流水平，自噬體及自噬溶酶體均增加。氯喹可抑制自噬體與溶酶體的結(jié)合，使足細胞內(nèi)自噬流水平降低，自噬溶酶體減少，但明顯增加自噬體的數(shù)量。本文的透射電鏡研究結(jié)果與此一致，進一步說明了淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松是通過調(diào)節(jié)足細胞自噬水平，從而發(fā)揮足細胞保護作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是調(diào)控細胞自噬的經(jīng)典通路，PI3K 激活后能夠產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 使Akt 磷酸化從而使其活化，Akt 能夠進一步激活mTOR 激酶[29-30]。mTOR 是自噬啟動階段的關鍵調(diào)節(jié)因子，mTOR 信號通路包括兩種功能蛋白復合物，即mTOR 復合物1（mTORC1）和mTOR 復合物2（mTORC2），二者均參與自噬的調(diào)節(jié)。其中mTORC1 是蛋白質(zhì)翻譯和核糖體合成的重要調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化作用抑制ULK1 的活性進而抑制自噬[31]。本研究的Western Blot 結(jié)果顯示，阿霉素損傷足細胞后，LC3-Ⅱ、PTEN 的表達減少，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達增加，說明阿霉素損傷大鼠足細胞后，PTEN 活性被抑制，PI3K/Akt/mTOR 信號通路被激活，足細胞的自噬活性降低。淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松干預后，LC3-Ⅱ、PTEN 的表達量增加，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達減少。說明藥物聯(lián)合治療后PTEN 的活性被抑制，激活了PI3K/Akt/mTOR 信號通路，上調(diào)了足細胞異常降低的自噬水平。加入自噬抑制劑氯喹后，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和p62 的表達量同步升高，而PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達量均未見明顯變化。這是因為氯喹阻斷自噬體與溶酶體的結(jié)合，導致LC3-Ⅱ病理性堆積，自噬系統(tǒng)受損，p62 也發(fā)生堆積。但是自噬信號通路相關蛋白的表達不受氯喹抑制。

淫羊藿又名仙靈脾，具有溫補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，其主要活性化合物為淫羊藿苷，具有抑制腎纖維化、保護腎臟的功能[32]，同樣也具有溫陽的效果[33]。黃貴華等[34]認為，自噬是對機體正虛邪實作出的一種自我調(diào)節(jié)方式。劉杰民等[35]認為自噬是機體在正氣虧虛下的自救方式。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷協(xié)同地塞米松治療增加了阿霉素足細胞中自噬活性。進一步闡明分子層面的細胞自噬現(xiàn)象仍然與中醫(yī)陰陽理論相契合。

基于上述研究，提示淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松對阿霉素誘導的足細胞損傷具有保護作用，體現(xiàn)在上調(diào)足細胞骨架蛋白synaptopodin 的表達。通過激活PTEN，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，調(diào)節(jié)足細胞自噬水平可能是其足細胞保護作用的內(nèi)在機制之一。

本實驗主要為體外研究，通過阿霉素足細胞株模型探討淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松的治療效果及可能的機制。不足之處為未觀察單獨藥物對自噬的影響，且體外研究有它的局限性，阿霉素足細胞株模型并不能完全代表阿霉素腎病綜合征模型。今后有待從體內(nèi)實驗來進一步證實其機制。