李瑞涵 ，周峻 ，梁志 ，高帥 ，全銳 ，翁習生 ，張彥瓊 ，林娜 ，陳衛(wèi)衡

1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2.北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730；3.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

恒古骨傷愈合劑由黃芪、人參、紅花、三七、杜仲、鱉甲、陳皮、鉆地風、洋金花組成，有活血益氣、補肝腎、接骨續(xù)筋、消腫止痛功效[1]。研究顯示，其通過上調(diào)核結(jié)合因子α1（Cbfa1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的表達，促進成骨細胞增殖和分化，促進壞死骨的修復，并通過激活網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞，提高患者痛閾，發(fā)揮抗炎作用，還能調(diào)節(jié)血脂、降低血液黏稠度、改善血液動力學、降低骨內(nèi)壓[2-4]。已被國內(nèi)外9項臨床指南和專家共識共同推薦，收錄于2015年版、2020年版《中華人民共和國藥典》，廣泛應用于膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）、腰椎間盤突出癥、新鮮性及陳舊性骨折等疾病的治療。隨著KOA發(fā)病率逐年上升[5]，恒古骨傷愈合劑的應用也日益增多。本研究著眼于KOA緩解期患者用藥特征及治療過程中恒古骨傷愈合劑單用與聯(lián)用的療效對比，并基于“病-證-癥-方”關聯(lián)網(wǎng)絡分析策略，揭示恒古骨傷愈合劑各成分的作用特點與生物內(nèi)涵，為明確該方的臨床定位和指導其合理用藥提供數(shù)據(jù)支持，為進一步研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

數(shù)據(jù)來源于“恒古骨傷愈合劑治療膝骨關節(jié)炎病例注冊登記系統(tǒng)”，由全國6個省份共20所醫(yī)院共同收集。華中地區(qū)6所、華北地區(qū)4所、西南地區(qū)4所、華東地區(qū)3所、西北地區(qū)3所，中醫(yī)院7所、西醫(yī)院13所，三級醫(yī)院16所、二級醫(yī)院4所。選取2020年5月－2021年12月使用恒古骨傷愈合劑（云南克雷斯制藥股份有限公司）的638例KOA患者中526例緩解期患者的醫(yī)療數(shù)據(jù)。

1.2 診斷與分期標準

參照1995 年美國風濕病學會KOA 診斷標準[6]。①近1個月內(nèi)反復膝關節(jié)疼痛；②年齡≥40歲；③晨僵≤30 min；④活動時有骨摩擦音/感；⑤X線片（站立位或負重位）示關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和/或囊性變、關節(jié)緣骨贅形成。符合①和②③④⑤中任意2條即可診斷。分期標準參考《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療指南（2020年版）》[7]，分為發(fā)作期[疼痛視覺模擬評分法（VAS）評分＞7分]、緩解期（VAS評分4～7分）、康復期（VAS評分＜4分）。X線分級參考Kellgren-Lawrence影像分級（K-L分級）方法[8]。

1.3 納入標準

符合上述診斷與分期標準的患者，醫(yī)囑中出現(xiàn)恒古骨傷愈合劑的應用記錄，患者使用恒古骨傷愈合劑期間的全部聯(lián)合用藥。

1.4 排除標準

排除患者非使用恒古骨傷愈合劑期間的聯(lián)合用藥。

1.5 數(shù)據(jù)規(guī)范化處理

參照《國際疾病分類》（ICD-11）[9]對西醫(yī)診斷名稱進行規(guī)范化處理。參照《中醫(yī)診斷學》[10]對中醫(yī)診斷信息進行規(guī)范化處理。藥物名稱參考藥品說明書進行規(guī)范化處理，化學成分相同但劑型、藥名不同的藥品合并為一種藥物。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般資料

整理中醫(yī)癥候流行病學調(diào)查表，統(tǒng)計患者年齡、性別、療程、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、K-L分級情況，對高頻癥候采用系統(tǒng)聚類分析。

1.6.2 主要療效指標

根據(jù)《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療指南（2020 年版）》[7]進行VAS評分和西安大略麥克馬斯特大學骨關節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）評分，WOMAC評分包括疼痛、僵硬、關節(jié)功能三部分。

1.6.3 聯(lián)合用藥

采用SPSS Modeler 18.0軟件Apriori算法對使用恒古骨傷愈合劑的KOA緩解期患者聯(lián)合用藥中排前20位藥物進行關聯(lián)分析。

1.6.4 恒古骨傷愈合劑的網(wǎng)絡調(diào)控機制研究

利用TCMIP2.0[11]平臺，對KOA 發(fā)生相關基因、KOA緩解期相關基因和恒古骨傷愈合劑候選靶點進行關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘。通過計算網(wǎng)絡拓撲特征值（節(jié)點連接度、介度、緊密度），篩選3個拓撲特征值均大于相應中位數(shù)的節(jié)點為核心節(jié)點，并基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫和Reactome通路數(shù)據(jù)庫進行功能挖掘。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0 和SPSS Modeler 18.0 軟件Apriori算法對數(shù)據(jù)進行分析。定量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時用±s表示，配對t檢驗進行組內(nèi)比較，t檢驗或方差分析進行組間比較；不符合正態(tài)分布采用配對符號秩進行組內(nèi)比較，秩和檢驗進行組間比較。定性數(shù)據(jù)組間比較采用卡方/Fisher檢驗，等級資料或療效部分組間比較采用秩和檢驗?；颊吣挲g、BMI、療程用±s表示；性別、K-L分級、VAS評分、用藥療程用頻數(shù)分析；聯(lián)合用藥采用頻數(shù)分析及Apriori算法進行關聯(lián)分析；VAS評分、WOMAC評分采用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 總體基線資料

使用恒古骨傷愈合劑的638例KOA患者中緩解期有526例（82.45%），一般資料見表1。VAS評分中位數(shù)為6分，平均（5.72±0.91）分，以6分、5分為主，通過肯德爾等級相關性分析發(fā)現(xiàn)，VAS評分與K-L分級不存在顯著相關性（P＞0.05），見表2。

表2 526例不同VAS評分KOA緩解期患者K-L分級［例（%）］

2.2 常見中醫(yī)癥候

頻次前5 位的癥候為腰膝酸軟（62.93%）、酸痛（57.22%）、刺痛（50.95%）、腰身重疼（48.76%）、腫脹（46.39%），見表3。采用聚類分析可分為3類：氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證（見圖1），再結(jié)合出現(xiàn)頻次前5 位的中醫(yī)癥候，可認為以上證型為KOA緩解期的主要證型。

圖1 使用恒古骨傷愈合劑KOA緩解期患者中醫(yī)癥候聚類

表3 526例使用恒古骨傷愈合劑KOA緩解期患者常見中醫(yī)癥候（前20位）

2.3 總體臨床療效

總體臨床療效評價顯示，VAS 評分平均下降（3.60±1.51）分，WOMAC 總分平均下降（50.00±24.84）分。見表4。

表4 526例使用恒古骨傷愈合劑KOA緩解期患者總體臨床療效（±s，分）

表4 526例使用恒古骨傷愈合劑KOA緩解期患者總體臨床療效（±s，分）

項目VAS評分WOMAC總分治療前5.72±0.91 96.16±28.17治療后2.14±1.35 46.16±23.62下降均值3.60±1.51 50.00±24.84 t值57.270 131.549 P值0.000 0.000

2.4 組間基線資料比較

526例患者中，單用組療程少于聯(lián)用組（P＜0.05），K-L 分級Ⅱ級以上患者比例低于聯(lián)用組（P＜0.05），VAS 評分≤6 分患者比例高于聯(lián)用組（P＜0.05），VAS 評分7 分患者比例低于聯(lián)用組（P＜0.05）。見表5、表6。

表5 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者基線資料比較

表6 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者VAS評分情況［例（%）］

2.5 聯(lián)合用藥種類

526例KOA緩解期患者中有173例聯(lián)用其他藥物?；颊咦钌俾?lián)合使用1種藥物，最多聯(lián)合使用5種。聯(lián)合藥物出現(xiàn)總頻次為380次，提取聯(lián)合用藥使用頻率前20位的藥物進行分析，前2位藥物依次是依托考昔、甲鈷胺。見表7。

表7 173例KOA緩解期患者聯(lián)合藥物使用頻次分析（前20位）

2.6 聯(lián)合用藥關聯(lián)規(guī)則

提取聯(lián)合用藥使用頻率前20位藥物進行分析，結(jié)果顯示，聯(lián)合應用2種西藥最常用的藥物組合是“依托考昔-甲鈷胺”，聯(lián)合應用1種中成藥、1種西藥最常用藥物組合是“依托考昔-金天格膠囊”，聯(lián)合應用2種中成藥組合支持度不足1.5%故不列出。見表8。

表8 KOA緩解期患者聯(lián)合2種藥物關聯(lián)分析（支持度＞1.5%）

2.7 聯(lián)合用藥品種關聯(lián)度

對聯(lián)合用藥前20位藥物進行關聯(lián)分析顯示，KOA緩解期患者臨床常用的聯(lián)合用藥依次是依托考昔-甲鈷胺、依托考昔-金天格膠囊。見圖2。

圖2 KOA緩解期患者聯(lián)合用藥關聯(lián)復雜網(wǎng)絡

2.8 2組臨床療效

2.8.1 單用組療效

353 例單用組患者治療后，其VAS 評分及WOMAC總分、疼痛評分、僵硬評分和關節(jié)功能評分均有顯著改善（P＜0.05）。見表9。

表9 單用組KOA緩解期患者療效指標比較（±s，分）

表9 單用組KOA緩解期患者療效指標比較（±s，分）

項目VAS評分WOMAC評分總分疼痛僵硬關節(jié)功能治療前5.63±0.88治療后2.01±1.39 t值42.529 P值0.000 93.46±29.87 19.76±6.91 5.84±3.87 67.86±21.87 41.73±25.75 9.40±6.17 2.47±2.58 29.86±18.30 36.377 32.323 18.688 36.425 0.000 0.000 0.000 0.000

2.8.2 聯(lián)用組療效

173 例聯(lián)用組患者治療后，其VAS 評分及WOMAC總分、疼痛評分、僵硬評分和關節(jié)功能評分均有顯著改善（P＜0.05）。見表10。

表10 聯(lián)用組KOA緩解期患者療效指標比較（±s，分）

表10 聯(lián)用組KOA緩解期患者療效指標比較（±s，分）

項目VAS評分WOMAC評分總分疼痛僵硬關節(jié)功能治療前5.90±0.95治療后2.40±1.23 t值72.664 P值0.000 95.44±26.42 20.46±5.78 4.40±4.00 70.58±20.09 45.05±25.55 9.94±5.87 2.00±2.36 33.10±18.75 48.468 45.314 34.872 46.360 0.000 0.000 0.000 0.000

2.8.3 組間療效比較

單用組治療前后VAS評分和WOMAC僵硬評分下降均值分別為（3.65±1.60）分和（3.37±3.38）分，聯(lián)用組下降均值較單用組分別減少了0.14分和0.97分，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表11、表12。

表11 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者總體療效比較（±s，分）

表11 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者總體療效比較（±s，分）

組別單用組聯(lián)用組H值P值例數(shù)353 173 VAS評分治療前5.63±0.88 5.90±0.95 3.334 0.974 WOMAC總分治療前93.46±29.87 95.44±26.42 3.111 0.607治療后41.73±25.75 45.05±25.55 3.516 0.008治療后2.01±1.39 2.40±1.23 3.370 0.000

表12 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者VAS評分和WOMAC評分下降均值比較（±s，分）

表12 單用組與聯(lián)用組KOA緩解期患者VAS評分和WOMAC評分下降均值比較（±s，分）

組別例數(shù)VAS評分WOMAC評分單用組聯(lián)用組H值P值353 173 3.65±1.60 3.51±1.32 2.559 0.01總分51.73±26.72 50.39±21.55-0.225 0.822疼痛10.37±6.03 10.52±4.42 0.576 0.565僵硬3.37±3.38 2.40±2.96-3.323 0.001關節(jié)功能38.00±19.60 37.48±16.32-0.780 0.938

2.8.4 恒古骨傷愈合劑治療膝骨關節(jié)炎緩解期的網(wǎng)絡調(diào)控機制挖掘

在TCMIP2.0“疾病相關分子庫”中，以KOA和單用組作用于KOA緩解期的優(yōu)勢療效環(huán)節(jié)（疼痛、僵硬）的英文詞條進行檢索，共收集到1 213個相關基因集。通路富集分析表明，相關基因主要參與調(diào)節(jié)機體“免疫-炎癥”平衡（Th7 cell differentiation、TNF signaling pathway、NF-κB signaling pathway、Nodlike receptor signaling pathway）、 骨 細 胞 代 謝（Osteoclast differentiation）、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)（Calcium signaling pathway）、細胞功能調(diào)節(jié)和能量代謝（PI3KAkt signaling pathway、Rap1 signaling pathway、JAKSTAT signaling pathway、MAPK signaling pathway）等相關通路。見圖3。

圖3 恒古骨傷愈合劑調(diào)控KOA緩解期相關基因KEGG通路富集分析

經(jīng)TCMIP2.0“中藥材數(shù)據(jù)庫”收集恒古骨傷愈合劑9味藥的化學成分信息，篩選方劑的候選靶點。再利用該平臺“中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡”的“病-證-方”關聯(lián)分析模塊，構(gòu)建“膝骨關節(jié)炎-疼痛、僵硬-恒古骨傷愈合劑”靶點相互作用網(wǎng)絡。通過計算網(wǎng)絡拓撲特征值（節(jié)點連接度、介度、緊密度），篩選3個拓撲特征值均大于相應中位數(shù)的節(jié)點為核心節(jié)點，得到362個核心節(jié)點，并基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫和Reactome通路數(shù)據(jù)庫進行功能挖掘。結(jié)果表明，恒古骨傷愈合劑有效緩解疼痛、改善僵硬的核心靶點基因主要參與改善骨細胞代 謝 （Collagen degradation、 RUNX2 regulates osteoblast differentiation、NCAM signaling for neurite out-growth）， 調(diào) 節(jié) 機 體“ 免 疫- 炎 癥” 平 衡（Interleukin-4 signaling pathway、 Interleukin-6 signaling pathway、Interleukin-10 signaling pathway、The NLRP3 inflammasome），恢復細胞功能及能量代謝（MAPK1(ERK2) activation、Signaling by FGFR4 in disease、FOXO-mediated transcription of oxidative stress，metabolic and neuronal genes）等。見圖4。

圖4 恒古骨傷愈合劑干預KOA緩解期優(yōu)勢療效環(huán)節(jié)的多維分子網(wǎng)絡

3 討論

3.1 臨床基本情況分析

KOA屬中醫(yī)學“痹證”“骨痹”范疇，其病機多為本虛標實，內(nèi)因為氣血營衛(wèi)虧虛，外因為風寒濕邪侵襲，中醫(yī)標本同治，因不良反應少、療效確切等優(yōu)勢，在其預防和治療中發(fā)揮了重要作用[12]。本研究共納入526例使用恒古骨傷愈合劑的KOA緩解期患者，女性多于男性，與國內(nèi)外的研究結(jié)果[13-14]一致，符合臨床實際。單用組平均年齡、療程均低于聯(lián)用組，且單用組VAS 評分7 分的患者占15.58%，少于聯(lián)用組的32.37%，說明聯(lián)合用藥患者隨著年齡的增長，病情加重，導致使用多種藥物進行聯(lián)合治療，且以中老年女性多發(fā)。

關節(jié)疼痛是KOA最為突出的癥狀，超過2/3的緩解期患者VAS評分為5～6分，這部分患者的K-L分級為0～Ⅳ級，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，VAS評分與K-L分級不存在顯著相關性，表明KOA的臨床癥狀和影像學分級并非完全一致?！豆顷P節(jié)炎診療指南（2018 年版）》提及KOA的K-L分級，但診療意見沒有因分級不同而有所差異[15]，因此2020年版中醫(yī)診療指南[7]將KOA分為發(fā)作期、緩解期和康復期，按階梯漸進方式，病證結(jié)合、辨證論治，給出個性化的中西醫(yī)結(jié)合治療方案，為臨床醫(yī)生進行KOA的規(guī)范中西醫(yī)結(jié)合診療奠定堅實基礎。

3.2 中醫(yī)癥候特點

本研究結(jié)果提示，KOA緩解期最常見的癥候為腰膝酸軟、酸痛、刺痛、腰身重疼、腫脹，通過系統(tǒng)聚類分析得出氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證是KOA緩解期的主要證型，與已有研究結(jié)果[7]一致，因此在應用中醫(yī)藥診療KOA緩解期患者時，應重視四診合參，精準辨證分型，根據(jù)癥候與證型特點進行個體化診療，充分發(fā)揮中醫(yī)辨證論治的優(yōu)勢。

3.3 臨床聯(lián)合用藥分析

本研究涉及針對KOA的聯(lián)合用藥共76種，在聯(lián)合用藥中，最常見的西藥是依托考昔（27.63%）、甲鈷胺（12.11%）。聯(lián)合用藥網(wǎng)絡分析結(jié)果顯示，關聯(lián)度前2位的組合為依托考昔-甲鈷胺、依托考昔-金天格膠囊。說明非甾體類抗炎藥、營養(yǎng)神經(jīng)藥等改善病情類藥物為治療KOA緩解期的廣譜用藥，與聯(lián)用組VAS評分6分以上者較多的臨床特征一致。恒古骨傷愈合劑臨床上多與非甾體抗炎藥、營養(yǎng)神經(jīng)類藥物、補腎健骨類中成藥聯(lián)合治療，因此在中西藥聯(lián)用時，應了解藥物的理化性質(zhì)與配伍禁忌，避免不合理聯(lián)用，明確中西醫(yī)診斷，中醫(yī)辨證與西醫(yī)辨病統(tǒng)一，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究制定出最佳的用藥方案。

3.4 臨床療效分析

526 例KOA 緩解期患者治療后VAS 評分、WOMAC評分均低于治療前（P＜0.05）；根據(jù)各項評分的下降均值進行療效對比，單用組VAS 評分、WOMAC僵硬評分平均下降均高于聯(lián)用組，表明對于KOA緩解期患者來說，無論是單獨用藥還是聯(lián)合用藥，均有確切療效。單獨用藥的患者在改善膝關節(jié)僵硬、緩解局部疼痛癥狀方面優(yōu)于聯(lián)合用藥患者，由此可見，單獨用藥的治療方案對伴有膝關節(jié)疼痛合并關節(jié)僵硬的KOA緩解期患者更適合。

3.5 恒古骨傷愈合劑改善膝骨關節(jié)炎緩解期疼痛、僵硬的作用機制

通過整合藥理學網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，在骨細胞代謝方面，KOA緩解期的主要病理環(huán)節(jié)為骨質(zhì)破壞。腎主骨，在體合骨，作為先天之本主導骨骼系統(tǒng)的發(fā)育和損傷修復。研究表明，杜仲水提物可誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化，有效上調(diào)Runx2基因表達，促進成骨分化和抑制破骨形成，達到骨保護的效果[16]；杜仲多糖通過調(diào)控NF-κB信號通路影響IL-1β誘導的軟骨細胞損傷[17]。因此，方中補腎健骨藥物多通過參與骨細胞代謝，使骨骼在腎精的推動下，氣血調(diào)和、肝腎相交，改善關節(jié)內(nèi)環(huán)境，延緩軟骨基質(zhì)降解，恢復成骨細胞活動，以保護軟骨、促進成骨。

在“免疫-炎癥”平衡調(diào)節(jié)方面，KOA緩解期的主要病理環(huán)節(jié)為局部炎性細胞浸潤引起的炎性疼痛。研究表明，鱉甲中多糖類通過加速炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，增強體外淋巴細胞活性，促進淋巴細胞增殖，起到抗炎作用[18-19]。洋金花中主要化合物槲皮素和內(nèi)酯類化合物通過抑制NF-κB表達，降低滑膜細胞IL-4和IL-6含量，抑制軟骨細胞自噬，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[20-22]。鉆地風有效成分芳樟醇抑制骨關節(jié)炎小鼠模型體現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛效果，抑制促炎因子是其抗急慢性疼痛的機制之一[23]。因此，方中所含消腫止痛藥物（鱉甲、洋金花、鉆地風）通過調(diào)節(jié)機體“免疫-炎癥”平衡相關通路，抑制炎性因子的釋放，發(fā)揮軟堅散結(jié)、消腫止痛的作用，從而緩解疼痛、炎性滲出積聚引起的關節(jié)僵硬等癥狀。

在細胞代謝和功能方面，KOA緩解期的主要病理環(huán)節(jié)為局部代謝紊亂引起的炎性介質(zhì)、疼痛因子代謝障礙停留局部所致的“不通則痛”。藥理研究顯示，黃芪多糖通過增加細胞葡萄糖的攝取和利用，降低骨骼肌細胞氧化應激水平[24]。黃芪甲苷、人參皂苷Rb1通過PI3K/AKT信號通路促進線粒體功能和生物合成，提高肌肉組織抗氧化能力，增強骨骼肌運動耐力，改善患肢功能，通過促進血管生長因子分泌調(diào)控血管新生、抑制滑膜組織增生，延緩KOA進程[25-26]。因此，方中所含補氣生血藥物（人參、黃芪）的主要功能可以概括為補氣活血止痛，通過參與細胞活動相關通路以恢復細胞能量和物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)細胞功能，改善能量供給，改善KOA 緩解期關節(jié)疼痛、活動不利等癥狀。

3.6 研究局限性

本研究數(shù)據(jù)來源于國內(nèi)20所醫(yī)院，是對臨床用藥的客觀真實記錄，因此可為臨床醫(yī)師及藥師的合理用藥提供有益的參考及依據(jù)。同時，由于醫(yī)院信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫并非專為科研目的而設，可能存在數(shù)據(jù)缺失、混雜等問題，影響研究的嚴謹性，因此本研究結(jié)論還需通過前瞻性研究進一步驗證。