丁夢(mèng)羽,肖葛瓊

(紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,浙江 紹興 312000)

肝癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第4大常見(jiàn)原因,也是發(fā)病率和死亡率逐年上升的少數(shù)腫瘤之一[1]。常規(guī)化療和放射治療對(duì)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的療效有限[2],HCC患者的五年生存率小于5%[3]。近年來(lái),微小RNA(miRNA)已被驗(yàn)證在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起顯著作用。Piao等[4]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-424-5p可以抑制肝癌細(xì)胞增殖,并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。KIF23屬于KIF家族,在多個(gè)腫瘤組織和細(xì)胞中高度表達(dá)[5]。已有研究[6]發(fā)現(xiàn),正常肝組織中未檢測(cè)到KIF23的拼接變異(KIF23 V1和KIF23 V2),卻在HCC組織中呈異常表達(dá)。KIF23的表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但KIF23對(duì)肝癌的調(diào)控機(jī)制還不明確。本研究探究miR-424-5p和KIF23在肝癌中的調(diào)控機(jī)制,以探索新的肝癌靶向治療途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常人肝細(xì)胞系HL-7702[L-02](BNCC100012)、人肝癌細(xì)胞系HCCLM3(BNCC351888)、MHCC97-L(BNCC337741)均購(gòu)買于北納生物。37 ℃、5% CO2的條件下,HL-7702[L-02]細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,HCCLM3和MHCC97-L細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-424-5p mimics(miR-mimics)、miR-NC、miR-424-5p inhibitor(miR-inhibitor)、inhibitor-NC以及pcDNA3.1-KIF23質(zhì)粒(oe-KIF23)和空的pcDNA3.1質(zhì)粒(oe-NC)均購(gòu)自Ribobio(中國(guó))。按照Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen,美國(guó))說(shuō)明書將miR-424-5p mimics、NC-mimics和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HCCLM3中,轉(zhuǎn)染24 h。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))按照制造商使用說(shuō)明書從細(xì)胞中提取總RNA,并使用iScript cDNA synthesis Kit(Bio-Rad,美國(guó))將miRNA和mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR-Green方法(Qiagen,德國(guó))在Bio-Rad CFX96定量實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上檢測(cè)miR-424-5p和KIF23的相對(duì)表達(dá),分別用U6和GAPDH作為內(nèi)部參照。用2-ΔΔCt方法分析miR-424-5p和KIF23的表達(dá)。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液以每孔約2×103個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有100 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔板中,分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h將10 μL CCK-8溶液(碧云天,中國(guó))添加到每個(gè)孔中。在37 ℃下孵育1.5 h后,使用Spectra Max 250分光光度計(jì)(Molecular Devices,美國(guó))測(cè)量450 nm的吸光度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞濃度為100個(gè)/mL離心收集細(xì)胞沉淀加入預(yù)冷75%乙醇于4 ℃固定后,用100 μL的RNase A(100 μg/mL,Sigma-Aldrich,美國(guó))處理細(xì)胞。再加入500 μL碘化丙啶(PI染液,50 μg/mL,Sigma-Aldrich, 美國(guó))后4 ℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter,美國(guó))分析細(xì)胞周期分布,結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。測(cè)定各組G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分比,并進(jìn)行比較。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將肝癌細(xì)胞(2×103個(gè)/孔)接種于6孔板培養(yǎng)板中,在FBS的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆(每個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)在50～150個(gè)左右)時(shí)終止培養(yǎng),用4%多聚甲醛固定細(xì)胞并用0.1%的結(jié)晶紫染色。使用配備有MicroPublisher 3.3 RTV相機(jī)的光學(xué)顯微鏡捕獲圖像,計(jì)算每孔的克隆數(shù)。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 使用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將細(xì)胞接種在6孔板中,當(dāng)細(xì)胞覆蓋達(dá)到80%時(shí)使用200 μL移液管尖端輕輕刮擦穿過(guò)孔中心的單層,然后用PBS洗細(xì)胞2次以去除劃下的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于0 h和24 h時(shí)拍照記錄。

1.8 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn) 使用位點(diǎn)突變法構(gòu)建野生型(wt)KIF23-WT和突變型(mut)KIF23-MUT 3’-UTR的pmirGLO載體(Promega,美國(guó))。使用Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen,美國(guó))將100 nM miR-mimics/miR-NC和KIF23-WT/KIF23-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HCCLM3中。轉(zhuǎn)染后48 h,通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega,美國(guó))檢測(cè)螢光素酶活性。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot,WB) 使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))測(cè)量蛋白質(zhì)濃度并定量,10% SDS-PAGE上電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Millipore,美國(guó)),室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜。將膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化。一抗為兔抗KIF23(Abcam,英國(guó))、GAPDH(Abcam,英國(guó)),二抗為山羊抗兔IgG(Abcam,英國(guó))。

1.10 生物信息分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲得肝癌組織中差異表達(dá)的miR-424-5p,并在TCGA肝癌的mRNA差異分析中篩選出2 244個(gè)在腫瘤組織中上調(diào)的mRNA,同時(shí)利用TargetScan、miRTarBase、mirDIP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-424-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并與上調(diào)的2 244個(gè)DEmRNA取交集獲得與miR-424-5p相關(guān)性最大的基因KIF23。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集分析KIF23在正常組織和癌組織中的表達(dá)水平。利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-424-5p和KIF23的結(jié)合位點(diǎn)(http://www.targetscan.org/mamm_31/)。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間數(shù)據(jù)差異比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-424-5p在肝癌中的表達(dá)情況 基于TCGA數(shù)據(jù)分析顯示,與正常組織比較,miR-424-5p在肝癌組織中顯著低表達(dá)(P<0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-424-5p在肝癌細(xì)胞系(HCCLM3、MHCC97-L)中的表達(dá)量(0.30±0.04、0.46±0.03)均低于正常人肝細(xì)胞系(HL-7702),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-424-5p對(duì)HCCLM3細(xì)胞生物功能的影響 轉(zhuǎn)染miR-424-5p-mimics/miR-NC至HCCLM3細(xì)胞系中,細(xì)胞的miR-424-5p表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)封三圖1A,可用于之后的實(shí)驗(yàn)。CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-424-5p過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力(1.09±0.08;26±3)低于NC組(1.42±0.09;54±4),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)封三圖1B、C。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-424-5p-mimics的細(xì)胞遷移能力(16.70±1.33)低于miR-NC的細(xì)胞(29.40±2.16),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)封三圖1D。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-mimics后HCCLM3細(xì)胞阻滯在G0/G1期(封三圖1E)。

2.3 敲低miR-424-5p對(duì)MHCC97-L細(xì)胞生物功能的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-inhibitor后的細(xì)胞miR-424-5p表達(dá)量(0.39±0.03)顯著下調(diào)(P<0.05)。CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組(1.38±0.13,60±6.0)相比,敲低miR-424-5p(1.88±0.17,123±11)明顯增強(qiáng)MHCC97-L細(xì)胞的增殖能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-inhibitor組的細(xì)胞遷移能力(37.0±4.0)高于inhibitor-NC組(26.0±3.0),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示抑制miR-424-5p的表達(dá)使得MHCC97-L細(xì)胞周期阻滯于S期。

2.4 miR-424-5p與KIF23在肝癌細(xì)胞中的關(guān)系 分析結(jié)果顯示,miR-424-5p和KIF23 3’-UTR具有結(jié)合位點(diǎn)(圖1A),miR-424-5p與KIF23有靶向結(jié)合關(guān)系(圖1B)。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示,KIF23在肝癌組織中的表達(dá)高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1C。qRT-PCR和WB 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KIF23在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)量(HCCLM3:2.50±0.20,MHCC97-L:2.10±0.18)均高于正常人肝細(xì)胞系,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1D、E。與miR-NC和inhibitor-NC組(1.00±0.10)相比,miR-424-5p過(guò)表達(dá)組的KIF23表達(dá)顯著下調(diào)(0.51±0.05);敲低miR-424-5p后,KIF23表達(dá)顯著上調(diào)(1.98±0.18);差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1F、G。

A.生信預(yù)測(cè)miR-424-5p與KIF23的靶向結(jié)合位點(diǎn);B.雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組的熒光素酶活性;C.KIF23在正常組和腫瘤組的表達(dá)量箱線圖;D.qRT-PCR檢測(cè)在正常細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中KIF23 mRNA 表達(dá)水平;E.Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中KIF23蛋白水平;F.qRT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組KIF23 mRNA的表達(dá);G.Western blot檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組KIF23蛋白表達(dá)情況;* P<0.05。圖1 KIF23與miR-424-5p在肝癌細(xì)胞中的關(guān)系Figure 1 The relationship of KIF23 and miR-424-5p in liver cancer cells

2.5 miR-424-5p與KIF23共同作用對(duì)肝癌細(xì)胞生物功能的影響 構(gòu)建對(duì)照組(miR-NC+oe-NC)、KIF23過(guò)表達(dá)組(miR-NC+oe-KIF23)、miR-424-5p和KIF23共過(guò)表達(dá)組(miR-mimics+oe-KIF23),qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oe-KIF23組中KIF23表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),KIF23過(guò)表達(dá)組、共過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中KIF23的表達(dá)量(3.10±0.30、1.12±0.10)與對(duì)照組相近(1.00±0.11),見(jiàn)圖2A、B。CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KIF23顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力,進(jìn)一步過(guò)表達(dá)miR-424-5p會(huì)抑制KIF23過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用(圖2C、D)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KIF23過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移能力(39.00±2.16)高于對(duì)照組(31.00±3.33)和共過(guò)表達(dá)組(33.00±2.57),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2E。

A、B.不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KIF23 mRNA和蛋白的表達(dá);C、D.CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力;E.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移能力;*P<0.05。圖2 miR-424-5p與KIF23共同作用對(duì)肝癌細(xì)胞生物功能的影響Figure 2 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the biological function of liver caner cells

2.6 miR-424-5p與KIF23共同作用對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示, KIF23過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期阻滯于S期,共過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,見(jiàn)圖3。

*P<0.05。圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析不同轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期分布情況Figure 3 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the cell cycle of liver cancer cells

3 討論

學(xué)者對(duì)miRNA在疾病中的發(fā)生和進(jìn)展作用機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究,發(fā)現(xiàn)miR-424-5p在多種癌癥中發(fā)揮不同的調(diào)控作用:miR-424-5p作為抑制基因在結(jié)直腸癌[7]、甲狀腺癌[8]等多種癌癥中抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,同時(shí)也能作為促癌因子促進(jìn)胃癌、胰腺癌等腫瘤的細(xì)胞增殖[9-10]。在本研究中,我們證實(shí)了miR-424-5p在肝癌細(xì)胞中低表達(dá),且miR-424-5p能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,使細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯于G0/G1期,說(shuō)明miR-424-5p在肝癌細(xì)胞中是抑癌因子,發(fā)揮抑癌作用。

近年來(lái),研究證實(shí)KIF23可作為肺癌[11]、胃癌[5]、卵巢癌[12]的潛在治療靶點(diǎn)。在有絲分裂晚期,中心紡錘體蛋白是由兩種成分組裝而成的復(fù)合體,而KIF23是這兩種必要成分之一,此復(fù)合體的形成被稱為細(xì)胞因子學(xué)的重要步驟[13]?；贙IF23在細(xì)胞周期中的重要地位,研究靶向KIF23的調(diào)控因子有助于揭示抑制腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。有研究[12]揭示在卵巢癌細(xì)胞中miR-424-5p能直接靶向抑制KIF23的表達(dá),從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移。此外,KIF23還作為膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn),KIF23過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展,減少KIF23的表達(dá)會(huì)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。KIF23還被證實(shí)在晚期肺癌和原發(fā)性肺癌的極大部分轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中過(guò)度表達(dá),因此抑制KIF23表達(dá)能夠有效抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。但KIF23在肝癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能研究較少,目前僅有Sun等[6]首次揭示了肝細(xì)胞癌中KIF23的表達(dá)及其表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性。在本研究中我們通過(guò)生信分析預(yù)測(cè)KIF23與miR-424-5p存在靶向關(guān)系,雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-424-5p與KIF2的靶向結(jié)合關(guān)系。通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)KIF23在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并且過(guò)表達(dá)KIF23后,肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在S期,當(dāng)同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-424-5p和KIF23后能削弱過(guò)KIF23對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移,細(xì)胞周期進(jìn)阻滯在G0/G1期。因此,在肝癌細(xì)胞中miR-424-5p能夠靶向下調(diào)KIF23的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述,本研究證明了在肝癌中miR-424-5p靶向KIF23調(diào)控細(xì)胞周期,抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,這個(gè)結(jié)論可為探索肝癌靶向治療途徑提供新的方向。