龐久彥,寇姣姣,康 平,王冬梅,周 玉

0 引言

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)是糖尿病患者最常見(jiàn)的威脅視力的并發(fā)癥,其能夠引起高滲透性視網(wǎng)膜毛細(xì)血管產(chǎn)生的細(xì)胞外液水平增加,造成黃斑增厚,導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變和視力喪失[1]。大約25%的2型糖尿病患者在首次診斷后10a內(nèi)發(fā)展為DME[2]。不同嚴(yán)重程度DME治療方法有所不同[3],因此迫切需要尋找與DME嚴(yán)重程度相關(guān)的因子,從而為臨床治療提供針對(duì)性意見(jiàn)。微小RNA(miRNA)是高度保守的內(nèi)源性ncRNAs的短序列(約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)),參與許多重要生物過(guò)程(包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡)[4]。miRNA具有很長(zhǎng)的半衰期,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在許多生物液體中是穩(wěn)定的,包括人血清、血漿、尿液、唾液、眼淚、房水和玻璃體液等[5]。miR-377-3p對(duì)多種疾病的發(fā)展有抑制作用,如后囊混濁[6]、糖尿病腎病[7]等。miR-365-3p與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)[8-9]。關(guān)于miR-377-3p和miR-365-3p與DME嚴(yán)重程度相關(guān)性的研究目前并不多見(jiàn),因此本研究通過(guò)檢測(cè)不同嚴(yán)重程度DME患者血清及房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平,研究其與DME嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象前瞻性研究。選取2021-02/2022-02三六三醫(yī)院收治的初診為DME患者60例60眼(如雙眼發(fā)病取嚴(yán)重眼入組,若兩眼程度一致取右眼)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均診斷為2型糖尿病并伴有黃斑水腫,黃斑水腫符合以下要求:1)距黃斑中心凹500μm內(nèi)視網(wǎng)膜增厚;2)距黃斑中心凹500μm內(nèi)硬性滲出伴相鄰視網(wǎng)膜增厚;3)距黃斑中心1個(gè)視盤(pán)直徑范圍內(nèi)超過(guò)1個(gè)視盤(pán)大小的視網(wǎng)膜增厚;(2)根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變和相關(guān)黃斑水腫的國(guó)際臨床分類標(biāo)準(zhǔn)[10]對(duì)DME患者進(jìn)行分組,輕度組24眼:視網(wǎng)膜后極部可見(jiàn)部分厚度增加及硬性滲出,距黃斑中心較遠(yuǎn)(大于1倍ODD半徑圓形區(qū)域);中度組21眼:視網(wǎng)膜后極部可見(jiàn)一定程度部分厚度增加,硬性滲出靠近黃斑中心,但未及1/3～1倍ODD環(huán)形區(qū)域;重度組15眼:視網(wǎng)膜厚度增加明顯,滲出累及黃斑中心;(3)臨床資料齊全;(4)最佳矯正視力(BCVA)為0.05～0.5;排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往玻璃體腔注藥史、全視網(wǎng)膜光凝史、閉角性青光眼病史;(2)1a內(nèi)腦梗塞病史、心機(jī)梗塞病史;(3)其他因素引起的黃斑水腫,如視網(wǎng)膜靜脈阻塞、葡萄膜炎、高血壓視網(wǎng)膜病變,脈絡(luò)膜新生血管,藥物及內(nèi)眼手術(shù)等。 另選同期本院收治的未發(fā)生DME的2型糖尿病患者60例作為對(duì)照組。對(duì)照組均診斷為2型糖尿病,無(wú)眼底病變,臨床資料齊全,排除標(biāo)準(zhǔn)同DME組。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意[倫理批號(hào):(2021)科研倫審第(045)號(hào)]。所有患者及家屬均知情同意并簽署同意書(shū)。

1.2 方法收集所有受試者基本臨床資料,包括BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓、高血脂、糖尿病病程。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖,全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)糖化血紅蛋白,酶法測(cè)定同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.1 采集血清樣本所有受試者采集清晨空腹肘靜脈血6mL,以3000r/min的速度離心10min,取上層血清,置于EP管中,-80℃冰箱存儲(chǔ),待檢。

1.2.2 采集房水樣本使用30號(hào)針頭于角膜緣(角虹膜緣3.5～4mm處進(jìn)針)刺入前房,通過(guò)透明角膜穿刺術(shù)收集DME患者約0.10mL房水。將房水樣品收集在無(wú)菌EP管中,2h內(nèi)進(jìn)行下一步處理,3000r/min離心10min以防止細(xì)胞/細(xì)胞碎片污染,取離心后上清液于-80℃儲(chǔ)存,所有操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.3qRT-PCR法檢測(cè)miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平使用RNA提取試劑盒(Aldrich,USA)提取總RNA。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems,USA)將提取的RNA合成cDNA。使用cDNA和SYBR green dye(Applied Biosystems,USA)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)分析,反應(yīng)體系:10μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,0.2μL正向引物,0.2μL反向引物,0.4μL ROX Reference Dye Ⅱ,6.0μL ddH2O;擴(kuò)增條件:95℃ 90s,95℃ 30s、63℃ 30s、72℃ 30s共循環(huán)40次,使用U6作為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1。各樣品重復(fù)3次,取平均值,使用2-ΔΔCt方法(Ct為循環(huán)閾值)計(jì)算目的基因miR-377-3p、miR-365-3p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較DME組患者60例其中男35例,女25例,年齡50～70(平均50.72±10.20)歲。對(duì)照組患者60例其中男33例,女27例,年齡51～71(平均51.35±11.32)歲,DME組患者糖尿病病程、糖化血紅蛋白、空腹血糖、Hcy均顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平比較DME組患者血清中miR-377-3p(0.67±0.18)和miR-365-3p(0.59±0.16)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(1.01±0.21,1.00±0.32),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.522,8.877,均P<0.01)。

2.3 不同嚴(yán)重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平及CMT比較DME組患者房水中miR-377-3p為0.35±0.11,miR-365-3p為0.46±0.13。DME組中輕度組24眼;中度組21眼;重度組15眼。不同嚴(yán)重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平及CMT比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。重度組患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平顯著低于中度組和輕度組,中度組顯著低于輕度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);重度組CMT顯著高于中度組和輕度組,中度組顯著高于輕度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 不同嚴(yán)重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平及CMT比較

2.4DME組患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平與CMT的相關(guān)性DME組患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平與CMT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.342、-0.374,均P<0.05);房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平與CMT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.425、-0.503,均P<0.05)。

2.52型糖尿病患者發(fā)生DME的多因素Logistic回歸分析以2型糖尿病患者是否發(fā)生DME為因變量,單因素分析中有差異的糖尿病病程、糖化血紅蛋白、空腹血糖、Hcy及血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達(dá)水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表4,糖尿病病程、空腹血糖及Hcy增加是2型糖尿病患者發(fā)生DME的危險(xiǎn)因素,血清中miR-377-3p和miR-365-3p是2型糖尿病患者發(fā)生DME的保護(hù)因素(P<0.05)。

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討論

DME發(fā)生的主要原因是黃斑增厚,其是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)患者視力喪失的最常見(jiàn)原因,隨著2型糖尿病的全球流行,其患病率不斷增加[11-12]。其病理生理學(xué)始于視網(wǎng)膜氧分壓降低,表現(xiàn)為由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和視網(wǎng)膜血管自動(dòng)調(diào)節(jié)介導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管通透性增高和血管內(nèi)壓升高[13]。在本研究中,糖尿病病程及Hcy均是2型糖尿病患者發(fā)生DME的危險(xiǎn)因素,這與Hsieh等[14]的研究結(jié)果類似,這可能是因?yàn)樘悄虿』颊唛L(zhǎng)期高血糖會(huì)影響DME的發(fā)展,Hcy在DME發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制尚不明確,可能與Hcy參與損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致微血管損傷相關(guān)[15]。

DME發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能與長(zhǎng)期高血糖及血糖相關(guān)的高滲透損傷視網(wǎng)膜微血管相關(guān)[14]。糖尿病患者長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致內(nèi)層視網(wǎng)膜灌注減少和內(nèi)層視網(wǎng)膜氧張力降低、毛細(xì)血管承受的血管內(nèi)壓力升高從而損害毛細(xì)血管,同時(shí),視網(wǎng)膜氧張力的降低上調(diào)VEGF和其他滲透性因子的合成,從而增加了微血管滲漏,細(xì)胞外液通過(guò)人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞的泵送作用重新進(jìn)入更下游的視網(wǎng)膜血管或穿過(guò)脈絡(luò)膜而被吸收[13]。Huai等[6]發(fā)現(xiàn),沉默miR-377-3p能夠逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,而miR-377-3p的上調(diào)能夠抑制TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞惡性變化。在本研究中,DME組患者血清中miR-377-3p水平明顯低于對(duì)照組,與Jiang等[16]的研究具有一致性,提示miR-377-3p與DME的發(fā)生有關(guān),分析原因?yàn)閂EGF是參與調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性的重要因子,在高糖環(huán)境下,VEGF過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致RPE細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)血管生成和血管通透性[17],從而引起DME,而VEGF是miR-377-3p的靶基因,MTT分析顯示miR-377-3p過(guò)表達(dá)導(dǎo)致RPE細(xì)胞增殖顯著減少,且miR-377-3p是DME的診斷標(biāo)志物[16]。進(jìn)一步比較不同嚴(yán)重程度DME患者miR-377-3p水平并分析發(fā)現(xiàn),miR-377-3p水平隨DME患者病情程度增加而降低,提示miR-377-3p與DME患者病情嚴(yán)重程度有關(guān),可能參與DME病情發(fā)展。為驗(yàn)證推測(cè),進(jìn)行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-377-3p水平與CMT呈負(fù)相關(guān),且miR-377-3p是2型糖尿病患者發(fā)生DME的保護(hù)因素,提示miR-377-3p可能參與2型糖尿病患者DME的發(fā)生發(fā)展且具有正向調(diào)控作用。

許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA在某些眼部疾病患者中存在差異表達(dá),有證據(jù)表明,miRNA在血清、玻璃體等中的表達(dá)水平與眼內(nèi)病理狀況有關(guān),針對(duì)影響視網(wǎng)膜的糖尿病并發(fā)癥,已發(fā)現(xiàn)一些miRNA在玻璃體和血清樣本中表達(dá)差異,如miR-145、miR-92a和miR-375,且其有作為生物標(biāo)志物或視網(wǎng)膜病變治療資源的潛力[18]。miRNA在調(diào)節(jié)幾個(gè)重要的生物學(xué)途徑和細(xì)胞功能中是必不可少的,研究表明,血清miRNA能夠作為各種疾病的生物標(biāo)志物,包括DR、DME[19]。據(jù)報(bào)道,多種miRNA與糖尿病患者DME有關(guān):通過(guò)PCR陣列檢測(cè)84個(gè)miRNA,Cho等[20]發(fā)現(xiàn),與白內(nèi)障患者相比,DME患者房水中59種miRNA的表達(dá)顯著下調(diào),Grieco等[19]研究表明,DME患者血漿及房水中miR-365-3p顯著下調(diào),miR-365是糖尿病的潛在治療靶點(diǎn),它能夠作為內(nèi)分泌信號(hào)分子和潛在疾病生物標(biāo)志物一樣發(fā)揮作用[20]。在本研究中,DME組血清miR-365-3p水平顯著低于對(duì)照組,與Grieco等[19]的研究具有一致性,提示miR-365-3p參與了2型糖尿病患者DME的發(fā)生過(guò)程,進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn),DME患者病情越嚴(yán)重,miR-365-3p水平越低,提示miR-365-3p可能與DME患者的病情進(jìn)展有關(guān),其可能正向調(diào)控DME病情,為驗(yàn)證推測(cè),進(jìn)行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-365-3p水平與CMT呈負(fù)相關(guān),且miR-365-3p是2型糖尿病患者發(fā)生DME的保護(hù)因素,驗(yàn)證了我們的推測(cè),提示miR-365-3p可能是2型糖尿病患者發(fā)生發(fā)展的重要正向調(diào)控因子。

綜上所述,miR-377-3p、miR-365-3p在DME患者血清中低表達(dá),與DME患者嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),臨床用來(lái)評(píng)估DME患者病情嚴(yán)重程度可能具有一定價(jià)值,或可依據(jù)miR-377-3p、miR-365-3p水平在DME患者血清和房水中的動(dòng)態(tài)變化及時(shí)進(jìn)行不同階段的針對(duì)性治療。但本研究納入樣本量相對(duì)較少、地域性較強(qiáng),并且缺乏動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),后續(xù)將擴(kuò)大樣本納入范圍繼續(xù)研究。