蔡 暉,宋 穎,石華宗,楊豫湘

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)作為糖尿病患者眼部的最常見并發(fā)癥,是導(dǎo)致視力下降、甚至失明的主要原因[1]。目前全球DR患者超過9300萬,伴隨糖尿病發(fā)病率的持續(xù)攀升和發(fā)病年齡逐漸年輕化,DR已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。目前針對DR的治療方法,如抗血管內(nèi)皮生長因子藥物的使用、玻璃體內(nèi)注射類固醇激素、激光光凝和手術(shù)治療等,雖然可以部分緩解疾病進(jìn)展,但療效仍不能令人滿意[2]。DR的主要病理變化是視網(wǎng)膜微血管病變,與高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMEC)功能障礙和血管生成增加密切相關(guān)。因此,如何逆轉(zhuǎn)HRMEC功能障礙和抗血管生成是眼科專業(yè)領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問題。作為一類非編碼RNA,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)參與多種病理生理過程,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和各種代謝過程,維持干細(xì)胞的干性潛能,參與炎癥和免疫反應(yīng)等[3]。近期研究發(fā)現(xiàn),miR-519d-3p參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展、骨關(guān)節(jié)炎和心肌梗死等疾病進(jìn)展[4-6],但在DR中的研究較少。本團(tuán)隊前期已報道,低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、炎癥、血管生成等方面具有重要作用[7],但調(diào)控HIF-1α的miRNA尚不清楚?；谏镄畔W(xué)分析推測HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因,值得對該現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步研究?；谝陨弦罁?jù),本研究采用高糖誘導(dǎo)HRMEC制作細(xì)胞模型,旨在明確miR-519d-3p對高糖誘導(dǎo)的HRMEC功能障礙和血管生成的影響,并闡明其對HIF-1α的調(diào)控機(jī)制,以期從細(xì)胞層面證實miR-519d-3p/HIF-1α軸在DR中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料HRMEC,由中山大學(xué)中山眼科中心提供;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(1001)、胎牛血清、生長因子、青霉素/鏈霉素溶液,上海中喬新舟生物科技有限公司;D-(+)-葡萄糖(ST1228)、細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(C0038)、Hoechst 33342染色試劑盒(C1029),上海碧云天生物技術(shù)公司;陰性對照模擬物(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)、miR-519d-3p模擬物(5’-CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG-3’)、HIF-1α過表達(dá)載體[將HIF-1α mRNA(NM_001530.4)編碼區(qū)序列插入pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建],上海吉瑪基因公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(L3000-015),美國賽默飛世爾科技公司;實時熒光定量PCR檢測試劑盒(638315),北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司;HIF-1α抗體(ab179483)、β-肌動蛋白(β-actin)(ab8227)抗體,上海艾博抗公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)相關(guān)人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)檢測試劑盒(EH0302)、人白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β檢測試劑盒(EH0185)、人IL-6檢測試劑盒(EH0201),武漢菲恩生物科技有限公司;Matrigel基質(zhì)膠(354234),美國康寧公司;HIF-1α野生型報告載體[包含miR-519d-3p結(jié)合位點(HIF-1α-wt)]、HIF-1α突變型報告載體[不包含miR-519d-3p結(jié)合位點(HIF-1α-mut)],廣州伯信生物科技公司;熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E1910),美國普洛麥格公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HRMEC復(fù)蘇后采用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設(shè)定為37℃、5% CO2、95%空氣。當(dāng)細(xì)胞生長至約90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,按1∶4傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳至2～3代后,取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 制作高糖細(xì)胞模型將D-(+)-葡萄糖用適量PBS溶液配制成5、30mmol/L濃度。取HRMEC在6孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×106個。向細(xì)胞中分別加入5、30mmol/L濃度葡萄糖培養(yǎng)48h,建立正常(NG)和高糖(HG)細(xì)胞模型。

1.2.3 實驗分組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照組:HG細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物;甘露醇組:在對照組基礎(chǔ)上加入25mmol/L甘露醇;miR-519d-3p過表達(dá)組:HG細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染miR-519d-3p模擬物;miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組:HG細(xì)胞模型共轉(zhuǎn)染miR-519d-3p模擬物和HIF-1α過表達(dá)載體。取HRMEC在6孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×106個,培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞生長至約70%～90%融合時,利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。對照組、甘露醇組、miR-519d-3p過表達(dá)組、miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染100pmol陰性對照模擬物、100pmol陰性對照模擬物、100pmol miR-519d-3p模擬物、50pmol miR-519d-3p和2.0μg HIF-1α過表達(dá)載體。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集細(xì)胞供后續(xù)使用。

1.2.4 實驗指標(biāo)

1.2.4.1 實時熒光定量PCR法檢測各組miR-519d-3p的表達(dá)情況提取各組細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用cDNA作為模版在ABI 7100熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:95℃ 20min,隨后95℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 30s,共40個循環(huán)。miR-519d-3p引物:5’- CAAAGTGCCTCCCTTTAGAGTG -3’(正向),5’- CGCAGGGTCCGAGGTATTC -3’(反向); U6引物:5’- CTCGCTTCGGCAGCACA -3’( 正向),5’- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’( 反向)。以U6為內(nèi)參對照,采用2-ΔΔCt法計算各組中miR-519d-3p的相對表達(dá)水平。

1.2.4.2Westernblotting法檢測各組HIF-1α蛋白的表達(dá)情況采用RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度。取40μg總蛋白依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉過程。隨后加入HIF-1α抗體(1∶1000稀釋)4℃過夜,以β-actin抗體(1∶10000稀釋)為內(nèi)參對照。第2d利用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5000)37℃孵育1h后,暗室添加超敏發(fā)光液并曝光膠片。利用Quantity-one軟件對蛋白條帶進(jìn)定量分析,計算HIF-1α蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-519d-3p和HIF-1α的結(jié)合位點情況取對照組和miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞在24孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個,培養(yǎng)過夜。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑向細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染0.8μg HIF-1α-wt和0.8μg HIF-1α-mut報告載體。培養(yǎng)24h后,裂解細(xì)胞,利用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組螢火蟲熒光值和海腎熒光值。以螢火蟲熒光值為內(nèi)參對照,計算相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=(海腎熒光值/螢火蟲熒光值)×100%。

1.2.4.4CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖情況取各組細(xì)胞在96孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為7×103個。培養(yǎng)24、48、72h后分別向細(xì)胞中加入12μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3h。采用多功能酶標(biāo)儀測定各組450nm波長時的吸光度(A)值。

1.2.4.5Hoechst33342染色法檢測各組細(xì)胞凋亡情況取各組細(xì)胞在24孔板細(xì)胞爬片中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個,培養(yǎng)48h。取出細(xì)胞爬片,采用4%多聚甲醛37℃固定30min,并以5%牛血清白蛋白37℃封閉1.5h。利用Hoechst 33342溶液在暗室中染色2min,通過熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞,并計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=[凋亡細(xì)胞數(shù)量(5個隨機(jī)視野)/總細(xì)胞數(shù)量(5個隨機(jī)視野)]×100%。

1.2.4.6ELISA法檢測各組細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達(dá)情況取各組細(xì)胞在24孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個,培養(yǎng)48h。收集各組細(xì)胞外液,將細(xì)胞外液加入反應(yīng)板中37℃孵育1h,并加入生物素化抗體工作液37℃孵育1h。隨后加入酶結(jié)合物工作液37℃避光孵育30min。最后加入顯色底物37℃避光孵育15min。通過多功能酶標(biāo)儀分析各組450nm波長下的A值,對比標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算TNF-α、IL-1β、IL-6濃度。

1.2.4.7 小管形成實驗檢測各組新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況將24孔板用Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪墊,放置30min使其硬化。取各組細(xì)胞在24孔板中鋪板,每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個,培養(yǎng)24h。采用倒置顯微鏡觀察新生毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成情況。采用Image-J軟件計算各組單個視野下新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1NG和HG細(xì)胞模型中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況比較實時熒光定量PCR法檢測NG和HG細(xì)胞模型中miR-519d-3p的表達(dá)水平分別為0.039±0.005和0.022±0.003,且與NG比較,HG中miR-519d-3p表達(dá)水平顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.62,P<0.01)。Western blotting法檢測NG和HG細(xì)胞模型中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平分別為0.104±0.009和0.627±0.044,且與NG比較,HG中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.53,P<0.01),見圖1。

圖1 Western blotting法檢測NG和HG細(xì)胞模型中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。

2.2 各組細(xì)胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況比較實時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞中miR-519d-3p的表達(dá)情況比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=171.89,P<0.01),且與對照組比較,miR-519d-3p過表達(dá)組和miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)水平均顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=38.90、29.16,均P<0.01)。Western blotting法檢測各組細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.53,P<0.01),且與對照組比較,miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著減少,而miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.21、44.72,均P<0.01)。對照組和甘露醇組細(xì)胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.17、0.13,均P>0.05),見圖2,表1。

表1 各組細(xì)胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況比較

圖2 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達(dá)組;D:miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組。

2.3miR-519d-3p和HIF-1α的結(jié)合位點檢測生物信息學(xué)分析顯示,HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以與HIF-1α 3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)中“GCACUUU”序列特異性結(jié)合,見圖3。熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測對照組和miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞中HIF-1α-wt載體的相對熒光素酶活性分別為5.237±0.485和2.309±0.183,且與對照組比較,miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞中HIF-1α-wt載體的相對熒光素酶活性顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.44,P<0.01);對照組和miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞中HIF-1α-mut載體的相對熒光素酶活性分別為5.081±0.357和4.837±0.392,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.497,P>0.05)。

圖3 miR-519d-3p和HIF-1α 3’-UTR之間的結(jié)合位點預(yù)測。

2.4 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況比較CCK-8法檢測各組細(xì)胞A值(24、48、72h)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.57、28.29、52.14,均P<0.01)。Hoechst 33342染色法檢測各組細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=74.46,P<0.01)。與對照組比較,miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞24、48、72h A值均顯著增加,細(xì)胞凋亡率顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.19、17.23、9.88、26.07,均P<0.01)。與miR-519d-3p過表達(dá)組比較,miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞24、48、72h A值均顯著減少,細(xì)胞凋亡率顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.65、8.41、5.32、32.02,均P<0.01)。對照組和甘露醇組細(xì)胞24、48、72h A值和細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.01、0.18、0.06、0.77,均P>0.05),見圖4,表2。

表2 各組細(xì)胞不同時間點細(xì)胞增殖和凋亡率比較

圖4 Hoechst 33342染色法檢測各組細(xì)胞凋亡情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達(dá)組;D:miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組。

2.5 各組細(xì)胞外液炎癥因子表達(dá)和血管生成情況比較ELISA法檢測各組細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.59、74.91、57.88,均P<0.01)。小管形成實驗檢測各組中新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=163.50,P<0.01)。與對照組比較,miR-519d-3p過表達(dá)組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均顯著減少,新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.94、25.28、7.29、16.19,均P<0.01)。與miR-519d-3p過表達(dá)組比較,miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均顯著增加,新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.32、17.05、26.81、6.34,均P<0.01)。對照組和甘露醇組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度和新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.20、0.32、0.55、0.17,均P>0.05),見圖5,表3。

表3 各組細(xì)胞外液炎癥因子表達(dá)和血管生成情況比較

圖5 小管形成實驗檢測各組新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達(dá)組;D:miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組。

3 討論

DR基本病理變化包括周細(xì)胞選擇性缺失、毛細(xì)血管基底膜增厚、微血管瘤形成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管導(dǎo)致的視網(wǎng)膜脫離。HRMEC在維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的完整性方面發(fā)揮重要作用,高糖引起HRMEC功能障礙,破壞血-視網(wǎng)膜屏障,導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出、脫離,促進(jìn)DR的發(fā)生和惡化。研究發(fā)現(xiàn),多種因素可以引起HRMEC功能障礙,如高級糖基化終產(chǎn)物積累、過氧化物酶體增殖體激活受體γ的失活、慢性炎癥、氧化應(yīng)激異常、生長因子及細(xì)胞因子表達(dá)失調(diào)等[8]。此外,高糖還會影響負(fù)責(zé)表觀遺傳修飾和非編碼RNA功能的酶的活性,導(dǎo)致非編碼RNA表達(dá)異常。近年來,miRNAs因其廣泛的調(diào)節(jié)功能而受到青睞,目前已發(fā)表的8篇相關(guān)論文共報道了93個miRNAs在DR患者和非DR患者中呈差異表達(dá),如miR-27b、miR-320a、miR-423-5p等[9],闡明這些miRNAs的作用機(jī)制將為DR治療提供新的線索。HG誘導(dǎo)HRMEC細(xì)胞模型是研究DR的常用體外模型,可用于研究該病的分子機(jī)制及防治策略。本研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)HRMEC模型中miR-519d-3p表達(dá)下調(diào),與既往文獻(xiàn)[5]報道一致,表明結(jié)果可信。隨后本研究通過一系列細(xì)胞實驗證實,miR-519d-3p可以減輕高糖誘導(dǎo)的HRMEC功能障礙并抑制血管生成。

高糖可以引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖失調(diào),加速DR進(jìn)展。同時,高糖還能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,而用抗氧化酶處理能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激,并降低細(xì)胞凋亡。研究顯示,炎癥因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6在DR進(jìn)展中起著重要作用[10]。持續(xù)的高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血性改變,刺激血管內(nèi)皮生長因子釋放,最終促進(jìn)新生血管生成。近年研究表明,一些異常表達(dá)的miRNAs在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,如miR-15b、miR-181、miR-373、miR-425-5p等,利用這些miRNAs有望開發(fā)DR治療的新靶點[11-14]。miR-519d-3p位于人基因組19q13.42區(qū)域,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥等過程。本研究利用miR-519d-3p模擬物在高糖誘導(dǎo)的HRMEC模型中成功過表達(dá)miR-519d-3p,經(jīng)CCK-8法和Hoechst 33342染色法發(fā)現(xiàn),miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞24、48、72h吸光度值較對照組均顯著增加,而細(xì)胞凋亡率較對照組顯著減少。該結(jié)果與miR-519d-3p在其他類型細(xì)胞中的功能一致,提示miR-519d-3p在DR中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。經(jīng)ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),miR-519d-3p過表達(dá)組細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度較對照組均顯著減少,提示miR-519d-3p在DR中具有抗炎作用。這一結(jié)果與miR-519d-3p在初級成纖維細(xì)胞中促炎作用相悖,具體原因有待進(jìn)一步考究。此外,小管形成實驗結(jié)果顯示,miR-519d-3p過表達(dá)組新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量較對照組顯著減少,與既往文獻(xiàn)[4]報道一致,提示miR-519d-3p在DR中具有抗血管生成作用?；谝陨辖Y(jié)果,可以得出miR-519d-3p在DR發(fā)生和發(fā)展中均具有重要作用。

眾多研究表明,miRNAs參與負(fù)性調(diào)控目的基因表達(dá),其作用方式主要通過與目的基因3’-UTR中特定核苷酸序列結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄或翻譯過程抑制。經(jīng)TargetScan 8.0(https://www.targetscan.org/vert_80/)、miRDB(https://mirdb.org/)、miRTarBase 7.0(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-519d-3p調(diào)控的目的基因,發(fā)現(xiàn)HIF-1α預(yù)測分?jǐn)?shù)較高,推測HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因。先前關(guān)于胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的研究中也曾報道,miR-519d-3p對HIF-1α具有負(fù)調(diào)控作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-519d-3p過表達(dá)組中HIF-1α蛋白表達(dá)水平較對照組顯著減少,提示miR-519d-3p對HIF-1α具有負(fù)調(diào)控作用。隨后經(jīng)熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可與HIF-1α中“GCACUUU”序列特異性結(jié)合,提示HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因。

HIF-1α蛋白分子量約為92kDa,作為腫瘤治療中的一個明星分子靶點,其廣泛參與細(xì)胞增殖和凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成及葡萄糖代謝等過程[17]。近年來,HIF-1α被報道與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Ilegems等[18]研究揭示HIF-1α可以介導(dǎo)糖尿病小鼠模型中胰島β細(xì)胞的損傷,而其抑制劑PX-478則可改善胰島β細(xì)胞的胰島素分泌指數(shù)。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)DR小鼠模型中視網(wǎng)膜血管生成與HIF-1α水平的增加密切相關(guān),沉默HIF-1α可以降低血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá),并以時間依賴的方式抑制血管生成。Jiang等[20]報道HIF-1α通過血紅素氧合酶1介導(dǎo)的對線粒體動態(tài)控制可以改善糖尿病腎病的腎小管損傷。本研究發(fā)現(xiàn),miR-519d-3p聯(lián)合HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞24、48、72h 吸光度值較miR-519d-3p過表達(dá)組均顯著減少,細(xì)胞凋亡率較miR-519d-3p過表達(dá)組顯著增加,細(xì)胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6濃度較miR-519d-3p過表達(dá)組均顯著增加,新生毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量較miR-519d-3p過表達(dá)組顯著增加,與既往文獻(xiàn)[19]報道結(jié)果一致,提示HIF-1α可以逆轉(zhuǎn)miR-519d-3p的作用。由此得出,HIF-1α是miR-519d-3p發(fā)揮功能的關(guān)鍵下游分子,miR-519d-3p/HIF-1α通路在DR發(fā)生和發(fā)展中均具有重要作用。

綜上所述,高糖誘導(dǎo)HRMEC模型中miR-519d-3p表達(dá)下調(diào),而HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因。miR-519d-3p靶向HIF-1α增加細(xì)胞增殖并降低細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),從而減輕高糖誘導(dǎo)的HRMEC功能障礙并抑制血管生成。本研究尚存幾點不足:(1)由于本研究不涉及組織樣本,故未能檢測miR-519d-3p和HIF-1α表達(dá)水平的相關(guān)性;(2)未能從基因干擾層面觀察沉默miR-519d-3p對高糖誘導(dǎo)的HRMEC功能障礙和血管生成的影響;(3)未能使用HIF-1α抑制劑佐證miR-519d-3p/HIF-1α通路的功能。