侯曉璐,崔冬梅, 牛靈芝,孫曉彤,于 濤, 趙宇航,宋愛(ài)萍,李 瑋

0 引言

氧化鋅納米顆粒(zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs)屬金屬氧化物產(chǎn)品,是一種多功能性的新型無(wú)機(jī)材料,顆粒大小約1～100nm。由于晶粒的細(xì)微化,氧化鋅納米顆粒表面電子結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,因此,具有普通氧化鋅無(wú)法比較的特殊性質(zhì),在眼科領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。作為新興的藥物載體,氧化鋅納米顆粒有使藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)、到達(dá)眼后部等優(yōu)點(diǎn),改變了傳統(tǒng)的眼部用藥方式[1]。黃嘯等[2]將氧化鋅納米顆粒表面修飾成藥物載體,把具有抗氧化作用的鋅和褪黑素運(yùn)送到視網(wǎng)膜,實(shí)現(xiàn)對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮層的聯(lián)合抗氧化作用。Agban等[3]將氧化鋅納米顆粒作為藥物載體,將毛果蕓香堿在眼內(nèi)持續(xù)作用時(shí)間延長(zhǎng)至14d,提高了青光眼患者的依從性和臨床治療效果。

隨著納米材料在眼科疾病診治等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,納米材料的眼健康問(wèn)題成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[4]。氧化鋅納米顆粒對(duì)紫外線UV-A和UV-B均具有良好的防護(hù)效果[5],因而被廣泛應(yīng)用于防曬霜和化妝品中。防曬霜和化妝品常應(yīng)用于靠近眼睛的地方,從而增加了氧化鋅納米顆粒眼部暴露的可能性。氧化鋅納米顆粒可以有效地減少和抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性微生物的生長(zhǎng),因此,氧化鋅納米顆粒已用于隱形眼鏡的護(hù)理液中[6]。角膜直接與外界環(huán)境接觸,最容易受到破壞,并發(fā)炎癥引起眼部損傷[7]。眼睛尤其是角膜,與皮膚和氣道一樣暴露于空氣中。由于角膜的免疫赦免狀態(tài)和對(duì)透明度的特殊要求,角膜對(duì)暴露可能做出不同于其他組織和器官的獨(dú)特方式反應(yīng)。目前大多數(shù)文獻(xiàn)的內(nèi)容都集中在納米材料眼科治療應(yīng)用方面的研究,有關(guān)角膜毒性及機(jī)制的研究較少。因此納米材料與眼睛的生物相容性和對(duì)人類的健康影響亟待系統(tǒng)的科學(xué)研究進(jìn)行評(píng)估。本研究選擇與眼科密切相關(guān)的新型納米材料——氧化鋅納米顆粒,通過(guò)構(gòu)建體內(nèi)和體外染毒模型,觀察氧化鋅納米顆粒對(duì)角膜的毒性影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料氧化鋅納米顆粒分散液及粉體(50～100nm)購(gòu)于杭州萬(wàn)景新材料有限公司。原代人角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cells,HCEpiC)購(gòu)于上海弘順生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco,C11995500BT),胎牛血清(Gibco,10270106),胰酶消化液(蘭杰柯科技有限公司,BL512A),青霉素-鏈霉素溶液(蘭杰柯科技有限公司,BL505A),磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Servicebio,G4202-500ML),MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Gibco,C0009S)、5%水合氯醛溶液(麥克林,C804539),熒光素鈉(麥克林,F809553)、蘇木精染液(Servicebio,G1004-100ML),伊紅染液(Servicebio,G1001-100ML),TNF-α一抗(Servicebio,GB11188),IL-6一抗(Servicebio,GB11117),HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(Servicebio,GB23303)。超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝,JY88-IIN)、超聲波清洗器(昆山,KQ-500VDE)。石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡,RM2235)、顯微鏡(OLYMPUS,BX51T)。

試驗(yàn)采用的輸電塔原型為100kV雙回路角鋼塔，塔高89.6m，呼高66m，基底寬度為17.315m，塔身頂部寬度為2.5m，在塔頂段23.6m范圍內(nèi)設(shè)置有三層橫擔(dān)，如圖3所示。輸電塔氣彈模型縮尺比為1∶50，模型材料為鋁材。為了盡量減小輸電塔模型各桿件節(jié)點(diǎn)處膠接導(dǎo)致的阻尼問(wèn)題，采用線切割方式沿高度方向分段整體雕刻輸電塔的主桿及斜直桿，而后沿各桿件軸線彎折為∟型模擬角鋼橫斷面，最后采用高強(qiáng)粘結(jié)劑連接模型各段，輸電塔模型的橫擔(dān)和塔腿也采用類似的制作方式。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明系(KM)雌性小鼠36只,4周齡,22～24g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心。將小鼠分籠飼養(yǎng)(5只/籠),溫度23℃±1℃、相對(duì)濕度恒定50%±10%、12h光照/12h暗循環(huán)交替照明,自由攝食和水,實(shí)驗(yàn)在小鼠適應(yīng)新環(huán)境7d后進(jìn)行。本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。本研究通過(guò)山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn){No.SYDWLS【2022】004號(hào)}。

1.2 方法

1.2.1 體外染毒實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 氧化鋅納米顆粒表征及配制使用X射線衍射儀(X-ray diffractometer,XRD)檢測(cè)氧化鋅納米顆粒的物理學(xué)特性,使用納米粒度儀檢測(cè)納米溶液分散指數(shù)。用細(xì)胞培養(yǎng)液將氧化鋅納米顆粒分散液配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度,每次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作前,納米分散液現(xiàn)配現(xiàn)用,使用前在超聲波清洗器水浴池里超聲震蕩10min,超聲分散結(jié)束,氧化鋅納米顆粒分散液用紫外線照射法滅菌。

1.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)及活性檢測(cè)原代人角膜上皮細(xì)胞在含有10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、89%高糖DMEM 培養(yǎng)液,37℃,5%CO2,濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代人角膜上皮細(xì)胞稀釋為7×104/mL,每孔100μL接種于96孔板,將培養(yǎng)板置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,分為空白對(duì)照組(除換液外不做任何處理)、氧化鋅納米顆粒實(shí)驗(yàn)組(在正常換液時(shí)加入經(jīng)超聲分散后0.5、5、12.5、25、50、100、250μg/mL分散液),各組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,于同樣條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,拍照記錄。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL, 0.5%MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔加入100mL DMSO,低速勻速搖晃20min,待結(jié)晶完全溶解,使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490nm處的OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。細(xì)胞存活率=氧化鋅納米顆粒實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組細(xì)胞OD值×100%。

1.2.2 體內(nèi)染毒實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 小鼠眼球染毒模型建立存在于化妝品中的氧化鋅納米顆粒暴露于皮膚的濃度為60～120μg/mL,故在此范圍內(nèi)設(shè)定氧化鋅納米顆粒溶液濃度。每次實(shí)驗(yàn)將12只小鼠分為4組:對(duì)照組(PBS溶液點(diǎn)眼),25、50和100μg/mL氧化鋅納米顆粒實(shí)驗(yàn)組,每組3只小鼠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,共計(jì)36只小鼠。每次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作前,納米分散液現(xiàn)配現(xiàn)用,使用前在超聲波清洗器水浴池里超聲震蕩10min,利用與細(xì)胞等滲、具有鹽平衡作用的PBS溶液,制備濃度為25、50和100μg/mL的氧化鋅納米顆粒懸液,配制好的氧化鋅納米顆粒懸液再置于渦旋混合器混勻3min,然后取10μL直接暴露于麻醉后的小鼠右眼眼表(結(jié)膜囊內(nèi)),每天3次,暴露7d。

1.2.2.3 角膜組織學(xué)觀察暴露7d后進(jìn)行角膜取材。5%水合氯醛溶液對(duì)小鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉,麻醉劑量:0.1mL/10mg。處死小鼠后小心取出眼球,置于40g/L多聚甲醛中于4℃固定24h,石蠟包埋,組織切片,厚度為4μm。將切好的石蠟切片于二甲苯中進(jìn)行脫蠟,HE染色,中性樹膠封片,鏡檢及拍照。利用Image J軟件對(duì)各組小鼠角膜上皮層厚度、基質(zhì)層厚度、每高倍鏡下基質(zhì)層免疫細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)量(相同角膜位置、同等放大倍率下拍照,計(jì)算免疫細(xì)胞數(shù)目)。

1.2.2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察TNF-α和IL-6的表達(dá)暴露7d后取眼球石蠟切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。脫蠟、梯度脫水,充分水洗。滴入3%過(guò)氧化氫溶液,室溫孵育25min,PBS清洗3min;用5%BSA覆蓋眼球組織,室溫封閉1h。輕輕甩掉封閉液,滴加TNF-α和IL-6一抗(TNF-α抗體稀釋比1∶200,IL-6抗體稀釋比1∶800),濕盒內(nèi)4°過(guò)夜孵育。PBS洗滌3次每次5min,加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗2滴,常溫孵育60min。采用DAB顯色,梯度酒精脫水,二甲苯使切片透明化5min;中性樹膠封片。用Image J軟件計(jì)算各組角膜基質(zhì)中表達(dá)TNF-α陽(yáng)性的免疫細(xì)胞數(shù)量、IL-6陽(yáng)性的免疫細(xì)胞數(shù)量、TNF-α相應(yīng)區(qū)域的平均光密度值(IOD值)以及IL-6相應(yīng)區(qū)域的IOD值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 納米溶液顆粒表征氧化鋅納米顆粒的XRD圖顯示氧化鋅納米顆粒2θ值中出現(xiàn)7個(gè)明顯的波峰,分別是31.7°、34.4°、36.2°、47.5°、56.6°、62.8°、68.0°,證實(shí)氧化鋅納米顆粒晶體的特質(zhì)。納米溶液分散指數(shù)PDI∶0.467,見(jiàn)圖1。

圖1 氧化鋅納米顆粒的XRD圖。

2.2 氧化鋅納米顆粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響正常培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則梭形,偽足纖長(zhǎng),隨著細(xì)胞的生長(zhǎng),偽足部分相互連接呈膜狀,同時(shí)細(xì)胞逐漸伸展,顯現(xiàn)成不規(guī)則的多邊形并聚集成蜂巢樣,細(xì)胞邊界清晰、胞漿豐富。隨著細(xì)胞密度的增加,偽足逐漸收縮,細(xì)胞間膜性連接不明顯,細(xì)胞排列越來(lái)越緊密,細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形,排列整齊,最后融合成清晰的磨玻璃樣外觀鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底,見(jiàn)圖2A。氧化鋅納米顆粒組細(xì)胞失去正常多邊形形態(tài),細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞呈現(xiàn)圓形,隨著處理濃度的升高,氧化鋅納米顆粒穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)沉積,致細(xì)胞死亡,見(jiàn)圖2B。

圖2 氧化鋅納米顆粒對(duì)人角膜上皮細(xì)胞形態(tài)的影響 A:正常角膜上皮細(xì)胞;B:人角膜上皮細(xì)胞暴露于0.5μg/mL氧化鋅納米顆粒24h的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3 MTT法檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞活性Welch檢驗(yàn)結(jié)果表明各組人角膜上皮細(xì)胞活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=448.3,P<0.0001)。兩兩比較結(jié)果表明,各組細(xì)胞活性與空白對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.5μg/mL氧化鋅納米顆粒組細(xì)胞存活率約為80%,5μg/mL氧化鋅納米顆粒組細(xì)胞存活率下降至約50%,細(xì)胞活力降低具有濃度依賴性,見(jiàn)圖3。

圖3 MTT法檢測(cè)不同濃度氧化鋅納米顆粒對(duì)人角膜上皮細(xì)胞活性的作用 aP<0.05, bP<0.01 vs空白對(duì)照組。

2.4 角膜熒光染色情況25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組可見(jiàn)點(diǎn)狀熒光素著染,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜中央的圓形混濁區(qū)見(jiàn)片狀著染,見(jiàn)圖4。

圖4 角膜熒光素鈉染色情況 A:PBS對(duì)照組;B:25μg/mL 氧化鋅納米顆粒組;C:50μg/mL氧化鋅納米顆粒組;D:100μg/mL氧化鋅納米顆粒組,箭頭示角膜中央混濁伴熒光素染色。

2.5 角膜組織HE染色情況與PBS對(duì)照組相比,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜出現(xiàn)明顯的病理特征,表現(xiàn)為角膜上皮層明顯變薄,上皮細(xì)胞層數(shù)明顯減少、上皮細(xì)胞數(shù)目明顯減少,基底部上皮細(xì)胞排列紊亂、分布不規(guī)則,細(xì)胞間出現(xiàn)海綿狀水腫;角膜基質(zhì)疏松、水腫,基質(zhì)層成纖維細(xì)胞肥大、增生,纖維母細(xì)胞增殖;炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)分布在角膜基質(zhì)層、角膜內(nèi)皮層及角膜緣,多聚集在角膜緣附近和角膜中央病變區(qū)的角膜基質(zhì)層和內(nèi)皮層。25μg/mL、50μg/mL氧化鋅納米顆粒組可見(jiàn)基質(zhì)水腫、成纖維細(xì)胞肥大,未見(jiàn)其他明顯病理改變,見(jiàn)圖5。

利用Image J軟件對(duì)各組小鼠的角膜上皮層厚度、角膜基質(zhì)層厚度、每高倍鏡下基質(zhì)層免疫細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行測(cè)量(由于角膜前彈力層、后彈力層及角膜內(nèi)皮層太薄,故在此未統(tǒng)計(jì)其厚度)。各組角膜上皮層厚度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=10.9,P<0.05)。100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜上皮層厚度與PBS對(duì)照組相比明顯變薄,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組角膜基質(zhì)層厚度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=12.8,P<0.01),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質(zhì)層與PBS對(duì)照組相比明顯增厚,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組角膜基質(zhì)層免疫細(xì)胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=10.7,P<0.05),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組基質(zhì)層免疫細(xì)胞數(shù)顯著增多,與PBS對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。

2.6 各組免疫組織化學(xué)染色情況陽(yáng)性細(xì)胞主要在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)著色,呈棕褐色顆粒。各氧化鋅納米顆粒處理組產(chǎn)生TNF-α、IL-6的角膜基質(zhì)免疫細(xì)胞數(shù)及角膜基質(zhì)TNF-α、IL-6的IOD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為H=8.2,P<0.05)。100μg/mL氧化鋅納米顆粒組產(chǎn)生TNF-α、IL-6的角膜基質(zhì)免疫細(xì)胞數(shù)及角膜基質(zhì)TNF-α、IL-6的IOD值均明顯高于PBS對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組免疫細(xì)胞數(shù)和IOD值與PBS對(duì)照組相比均無(wú)明顯增高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖7、8。

圖7 各組角膜免疫組織化學(xué)染色情況 A:角膜基質(zhì)內(nèi)表達(dá)TNF-α免疫組織化學(xué)染色圖;B:角膜基質(zhì)內(nèi)表達(dá)IL-6免疫組織化學(xué)染色圖。

圖8 角膜基質(zhì)內(nèi)表達(dá)TNF-α和IL-6陽(yáng)性的免疫細(xì)胞數(shù)量和平均光密度值 A:表達(dá)TNF-α陽(yáng)性的免疫細(xì)胞數(shù)量;B:表達(dá)IL-6陽(yáng)性的免疫細(xì)胞數(shù)量;C:表達(dá)TNF-α陽(yáng)性的平均光密度值;D:表達(dá)IL-6陽(yáng)性的平均光密度值;aP<0.05 vs PBS對(duì)照組。

3 討論

角膜是兼具屈光功能和屏障功能的透明組織。眼表的解剖、生理及物理屏障使藥物不易進(jìn)入眼內(nèi),生物利用度往往低于5%[8]。納米材料體積小,表面積大,能夠跨越生物屏障[9-10]。納米制劑被廣泛應(yīng)用于眼科藥物運(yùn)送載體[11]。納米顆粒也廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域,并存在于空氣污染物[12-13]中,這些都增加了眼部尤其是角膜暴露的風(fēng)險(xiǎn)。目前,納米材料對(duì)眼睛組織結(jié)構(gòu)的影響仍然知之甚少。因此,本研究選擇與眼科密切相關(guān)的氧化鋅納米顆粒,從體外和體內(nèi)兩方面評(píng)估納米顆粒的角膜安全性。

目前,有關(guān)氧化鋅納米顆粒眼部安全性的體外實(shí)驗(yàn)局限于視網(wǎng)膜和晶狀體。Guo等[14]采用大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGC)與不同濃度的氧化鋅納米顆粒溶液作用。實(shí)驗(yàn)表明5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用24h顯著降低RGC-5細(xì)胞活力,2.5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用48h顯著降低RGC-5細(xì)胞活力,呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性特征。小鼠光感受器細(xì)胞(661W細(xì)胞系)暴露于不同濃度氧化鋅納米顆粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)31.25μmol/L作用24h降低細(xì)胞活力[15]。Wang等[16]采用人晶狀體上皮細(xì)胞,與不同濃度氧化鋅納米顆粒溶液相作用,實(shí)驗(yàn)顯示5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用24h顯著降低細(xì)胞活力。角膜上皮是抵御病原微生物侵襲角膜的第一道屏障[17],角膜上皮的正常結(jié)構(gòu)和功能對(duì)維持角膜的透明性和發(fā)揮屏障功能至關(guān)重要。因此,本研究選擇體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察體外狀態(tài)下氧化鋅納米顆粒的安全性。通過(guò)本研究中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞暴露于0.5μg/mL的氧化鋅納米顆粒24h,與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞活力明顯下降。本研究證實(shí)了短期暴露于較低濃度氧化鋅納米顆粒,可對(duì)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,并具有濃度依賴性的特征。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),證明了氧化鋅納米顆粒對(duì)角膜上皮細(xì)胞的高度毒性作用,并為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)濃度選擇是基于體外最小損傷濃度的100倍,原因是淚膜作為眼表的第一個(gè)功能屏障,當(dāng)外源性物質(zhì)進(jìn)入眼內(nèi),會(huì)在30s內(nèi)通過(guò)反射性流淚、眨眼和淚道引流的方式被稀釋[18]。商用防曬霜產(chǎn)品含有高達(dá)25%w/w(通常為10%～20%w/w)的氧化鋅納米顆粒。單次應(yīng)用于人體皮膚后相當(dāng)于暴露于60～120μg/mL的氧化鋅納米顆粒[19]。因此,本研究中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的濃度與氧化鋅納米顆粒在眼表的潛在生理暴露量一致。100μg/mL氧化鋅納米顆粒點(diǎn)眼5d,角膜見(jiàn)點(diǎn)片狀熒光素著染;25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒點(diǎn)眼7d,角膜可見(jiàn)熒光素的點(diǎn)狀著染。研究結(jié)果說(shuō)明氧化鋅納米顆粒會(huì)造成角膜屏障功能破壞,引起小鼠角膜上皮損傷,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。HE染色結(jié)果顯示,與PBS對(duì)照組相比,25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組的角膜上皮層厚度、基質(zhì)層厚度、基質(zhì)層免疫細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯改變(P>0.05),而100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜上皮層變薄、角膜基質(zhì)層變厚、基質(zhì)層免疫細(xì)胞明顯增多(均P<0.05),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質(zhì)層顯著增厚、水腫,基質(zhì)纖維增生,并出現(xiàn)大量免疫細(xì)胞。Kim等[20]將不同濃度的氧化鋅納米顆粒暴露于兔眼的結(jié)膜囊,結(jié)果發(fā)現(xiàn)淚膜無(wú)明顯改變,但未對(duì)角膜進(jìn)行綜合評(píng)估。氧化鋅納米顆?？赏ㄟ^(guò)角膜上皮細(xì)胞的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入角膜深層[21]。與角膜上皮相比,角膜基質(zhì)對(duì)納米顆粒的屏障作用更為強(qiáng)大。角膜基質(zhì)由緊密堆疊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成,類似于分子篩的功能,篩孔的直徑只有20～40nm[22],本研究中氧化鋅納米顆粒直徑50～100nm,超過(guò)了角膜基質(zhì)多重網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的篩孔直徑,可能是毒性影響局限在角膜的主要原因。

已有研究表明,氧化鋅納米顆?？稍谏眢w其他系統(tǒng)中誘發(fā)炎癥[23]。誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是納米顆粒在化妝品和防曬霜中的潛在毒性問(wèn)題[20]。本次實(shí)驗(yàn)表明,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質(zhì)層含有TNF-α、IL-6的免疫細(xì)胞顯著增多且TNF-α和IL-6的IOD明顯高于對(duì)照組(均P<0.05),25μg/mL和50μg/mL的氧化鋅納米顆粒的TNF-α、IL-6表達(dá)未見(jiàn)明顯增高(均P>0.05),證明一定濃度的氧化鋅納米顆粒會(huì)引起小鼠眼球發(fā)生炎癥反應(yīng)且具有炎癥反應(yīng)程度具有濃度依賴性。Senapati等[24]認(rèn)為JNK、ERK1/2和p38為構(gòu)成MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng),在氧化鋅NPs的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。他們的實(shí)驗(yàn)表明,氧化鋅納米顆粒通過(guò)內(nèi)吞作用或吞噬作用進(jìn)入人單核細(xì)胞,誘導(dǎo)該細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,激活NF-κB信號(hào)通路,增加IL-1β和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,這些炎癥細(xì)胞因子進(jìn)一步激活JNK、ERK1/2和p38在內(nèi)的MAPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),引發(fā)促炎反應(yīng)和基因毒性。

本研究仍存在局限性。納米顆粒的性質(zhì)、大小、表面修飾等因素都有可能影響眼毒性作用,未來(lái)將進(jìn)一步細(xì)化納米顆粒。納米顆粒對(duì)細(xì)胞損傷相關(guān)的機(jī)制如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、細(xì)胞自噬、離子通道改變和物理?yè)p傷等,這些機(jī)制是否參與了氧化鋅納米顆粒的眼毒性,下一步將繼續(xù)研究。

綜上所述,通過(guò)體外和體內(nèi)的研究,證實(shí)了氧化鋅納米顆粒對(duì)角膜具有毒性損傷作用。該研究豐富了氧化鋅納米顆粒眼毒性的數(shù)據(jù),提醒在納米材料廣泛應(yīng)用的同時(shí)應(yīng)警惕毒性作用,為氧化鋅納米顆粒眼部安全性評(píng)價(jià)提供了一定的理論依據(jù)。