付道通, 劉長(zhǎng)杰, 張益民

骨關(guān)節(jié)炎是臨床最常見(jiàn)的退行性疾病,也是老年人殘疾的主要原因,為患者及其家庭帶來(lái)巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。目前,臨床尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)節(jié)炎治療方法,其治療目的主要是延緩疾病進(jìn)展、緩解疼痛,部分患者最終可能會(huì)發(fā)展為終末期[3]。因此,目前亟需尋找骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物,以促進(jìn)高危患者的早期篩查和干預(yù),改善患者預(yù)后。既往研究顯示,sestrin2過(guò)表達(dá)可增加磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活蛋白激酶信號(hào)的活性,恢復(fù)線粒體生物發(fā)生并抑制神經(jīng)炎癥,進(jìn)而減輕骨關(guān)節(jié)炎疼痛[4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)可協(xié)調(diào)骨關(guān)節(jié)炎顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬和凋亡信號(hào),與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。鑒此,本研究旨在分析骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性,以期為臨床治療方案的制定提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2019年10月至2022年10月濰坊市人民醫(yī)院收治的骨關(guān)節(jié)炎患者120例,均接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù),根據(jù)患者術(shù)后6個(gè)月的Lysholm評(píng)分情況將其分為預(yù)后不良組(<70分,31例)和預(yù)后良好組(≥70分,89例)[6]。兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見(jiàn)表1。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(19Z0235),患者知情同意參與。

表1 兩組基線資料比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)CT或彩色多普勒超聲檢查,符合《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2018年版)》[7]中關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)單側(cè)病變;(3)患者臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并骨結(jié)核、骨腫瘤或其他骨代謝異常疾病者;(2)合并其他急慢性炎癥性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病者;(3)有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎者;(4)認(rèn)知障礙或精神異常疾病者。

1.3治療方法 參考《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2018年版)》[7]對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療?；颊呷∑脚P位,行持續(xù)硬膜外聯(lián)合蛛網(wǎng)膜下腔阻滯麻醉。患肢安裝止血帶,于膝前正中取切口,采集滑膜組織(0.2 cm×0.2 cm),切除后方所有骨贅,于股骨遠(yuǎn)端截骨,髓內(nèi)定位。于股骨遠(yuǎn)端切入開(kāi)口,長(zhǎng)桿置入深度需達(dá)股骨峽部,短桿置入深度約為20 cm。行脛骨平臺(tái)截骨,骨水泥固定。

1.4滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平檢測(cè) 采用超聲波粉碎滑膜組織后于無(wú)菌環(huán)境中加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)進(jìn)行研磨,制成勻漿后以3 000 r/min離心15 min,取上清液轉(zhuǎn)移至干燥潔凈EP管中,-80 ℃保存?zhèn)錂z。應(yīng)用RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)提取滑膜組織的總RNA,后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄得cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。所用引物序列見(jiàn)表2。以GAPDH為內(nèi)參,通過(guò)2-△△CT法計(jì)算sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

1.5關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物檢測(cè) 于患者入院后24 h內(nèi)無(wú)菌抽取關(guān)節(jié)液1 ml,3 000 r/min離心10 min后取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)水平,檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華爾納生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1兩組滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物表達(dá)水平比較 預(yù)后不良組mTORC1 mRNA、IL-8、IL-6、TNF-α水平顯著高于預(yù)后良好組(P<0.05),sestrin2 mRNA水平顯著低于預(yù)后良好組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物表達(dá)水平比較

2.2骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA與關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA水平與關(guān)節(jié)液IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),mTORC1 mRNA水平與IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA與關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物的Pearson相關(guān)分析結(jié)果

2.3影響骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后不良的多因素logistic回歸分析結(jié)果 以骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后情況為因變量(預(yù)后不良=1,預(yù)后良好=0),以滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA,以及關(guān)節(jié)液IL-8、IL-6、TNF-α為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示,滑膜組織mTORC1 mRNA表達(dá)水平上升是促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后不良發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),而較高水平的sestrin2 mRNA是抑制骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后不良發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 影響骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后不良的多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.4滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平能有效預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況(P<0.05),且兩者聯(lián)合的預(yù)測(cè)效能更優(yōu)[AUC(95%CI)=0.906(0.848～0.963),P<0.001],靈敏度和特異度分別為93.53%、78.76%。見(jiàn)表6,圖1。

表6 滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的ROC曲線分析結(jié)果

圖1 滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的ROC曲線圖

3 討論

3.1骨關(guān)節(jié)炎作為一種非炎性滑膜關(guān)節(jié)退行性疾病,影響全球60歲以上10%的男性和16%的女性,其主要特征是軟骨破壞、軟骨下骨損傷、滑膜炎癥和骨贅形成[8]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與年齡、勞損、創(chuàng)傷等多種因素有關(guān),但確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚[9]。骨關(guān)節(jié)炎可涉及身體各部位關(guān)節(jié),包括身體承重關(guān)節(jié)膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)和脊柱,嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的正常功能和患者生活質(zhì)量,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致殘疾[10]。由于目前缺乏骨關(guān)節(jié)炎早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的有效方法,使得許多患者確診時(shí)疾病已發(fā)展至終末期,需行關(guān)節(jié)置換手術(shù),給患者帶來(lái)較大的負(fù)擔(dān)[11-12]。

3.2sestrin2是一種高度保守的蛋白分子,位于編碼基因6號(hào)染色體,屬于sestrin家族。其不僅參與調(diào)控心血管疾病,而且在癌癥、椎間盤(pán)退變、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用[13]。sestrin2是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,可調(diào)控AMP激活蛋白激酶-mTORC1通路,對(duì)抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞毒性有細(xì)胞保護(hù)作用[14]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種高度保守的蛋白激酶,其中mTORC1是雷帕霉素的敏感靶點(diǎn),與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[15-16]。本研究結(jié)果顯示,滑膜組織中sestrin2 mRNA呈低表達(dá),mTORC1 mRNA呈高表達(dá),推測(cè)sestrin2、mTORC1參與骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展的可能機(jī)制為:(1)低表達(dá)sestrin2對(duì)mTORC1的抑制作用降低,骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)抗氧化應(yīng)激和抗炎癥作用降低,炎癥及其誘導(dǎo)的分解代謝作用使軟骨功能改變,導(dǎo)致疾病進(jìn)展。既往研究表明,炎癥及其誘導(dǎo)的分解代謝作用可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、軟骨功能改變、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步分解,進(jìn)而在骨關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[17-18]。(2)sestrin2表達(dá)降低,使得其抑制細(xì)胞凋亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的功能減弱。Tu等[19]研究發(fā)現(xiàn),sestrin2可通過(guò)抑制mTORC1和激活A(yù)MP激活蛋白激酶信號(hào)活性增強(qiáng)自噬,進(jìn)而抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解。另外,本研究結(jié)果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平與關(guān)節(jié)液炎性標(biāo)志物均具有顯著相關(guān)性。分析認(rèn)為這一現(xiàn)象可能是由于骨關(guān)節(jié)炎患者機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),啟動(dòng)了滑膜組織的成骨功能。既往文獻(xiàn)報(bào)道顯示,炎性因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均與骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)功能及臨床癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)[20],進(jìn)一步佐證了sestrin2、mTORC1與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)性。提示在臨床治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí),臨床醫(yī)師不僅需要重視控制炎癥反應(yīng),亦應(yīng)關(guān)注軟骨細(xì)胞數(shù)量以及軟骨功能的改變情況。

3.3本研究結(jié)果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平均可有效預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)炎患者的預(yù)后情況,且二者聯(lián)合的預(yù)測(cè)效能更高,靈敏度和特異度分別達(dá)93.53%、78.76%。據(jù)此,對(duì)于滑膜組織sestrin2 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于0.86、mTORC1 mRNA高于1.27的骨關(guān)節(jié)炎患者,臨床醫(yī)師應(yīng)予以重視,積極調(diào)整治療方案以改善患者預(yù)后。

綜上所述,滑膜組織sestrin2 mRNA表達(dá)水平降低、mTORC1 mRNA表達(dá)水平升高與骨關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后不良相關(guān),這為臨床早期診治提供了新思路。但對(duì)于sestrin2和mTORC1誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。