張福漢 管瑛瑛 陳桓 許建芳

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院 福建 廈門 361006）

甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，屬于一種起源于甲狀腺濾泡上皮或?yàn)V泡上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。已有研究證實(shí)，甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展受到不同的癌基因及多種生長(zhǎng)因子影響，且發(fā)病機(jī)制與原癌基因序列的過(guò)度表達(dá)、突變或缺失等密切相關(guān)[1]。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移已被認(rèn)為是致癌癥患者死亡的主要原因之一，其中細(xì)胞周期調(diào)控在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。組織蛋白激酶B（Akt）是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要角色。Akt可通過(guò)與多個(gè)信號(hào)通路的聯(lián)系，從而參加細(xì)胞周期進(jìn)程、分化及遷移，也是重要的信號(hào)節(jié)點(diǎn)[3]。細(xì)胞周期素D1（CCND1）是細(xì)胞調(diào)控中重要的調(diào)控因子，是細(xì)胞周期中G1 期進(jìn)入S 期調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵點(diǎn)，而該點(diǎn)調(diào)控異常被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4]。已有臨床研究表明，CCND1 在乳腺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可能與治療療效及預(yù)后密切相關(guān)[5]。本研究前瞻性選取醫(yī)院收治的100 例甲狀腺癌患者為研究對(duì)象，測(cè)定甲狀腺癌組織與配對(duì)癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，分析甲狀腺癌組織中Akt、CCND1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性選取醫(yī)院2019年8月至2022年8月收治的甲狀腺癌患者100 例為研究對(duì)象，其中男33 例，女67 例；年齡24～68 歲，平均（44.32±7.48）歲；體質(zhì)量指數(shù)22.6～30.3 kg/m2，平均（24.76±2.31）kg/m2；病理類型：乳頭狀癌63 例，濾泡癌28 例，髓樣癌9 例；分化程度：高分化27 例，中分化48 例，低分化25 例；臨床分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期17 例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：倫理字201800116 號(hào)）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)室檢查確診；（2）年齡≥18 歲；（3）對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情，自愿參與并簽署知情同意書；（4）接受病理檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能不全者；（3）合并嚴(yán)重自身免疫系統(tǒng)功能障礙者；（4）伴有凝血功能障礙者；（5）嚴(yán)重精神及認(rèn)知功能障礙者。

1.3 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 取患者甲狀腺癌及癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)：將甲狀腺癌組織及癌旁組織樣本經(jīng)甲醛溶液固定后，用石蠟包埋，并將其切成4 μm 厚度的切片；經(jīng)脫蠟處理后，使用梯度濃度酒精溶液進(jìn)行脫水處理；使用pH 6.0 的枸櫞酸鹽緩沖液對(duì)切片進(jìn)行浸泡修復(fù)抗原；再將切片放置在3%過(guò)氧化氫溶液中（室溫下）孵育10 min，孵育完成后使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,PBS）進(jìn)行3 次洗滌，使用封閉液封閉；將每份切面分別加入50 μl 鼠抗人Akt 抗體、CCND1 蛋白，放大倍數(shù)為1:2000，以4℃溫度進(jìn)行孵育過(guò)夜，經(jīng)PBS洗滌后加入抗體（兔抗鼠Akt、CCND1），放大倍數(shù)為1:5000，孵育1.5 h；使用DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理，采用中興樹膠進(jìn)行封片，于顯微鏡下觀察。若陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%則記0 分，10%≤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%記1 分，25%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%記2 分，50%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤75%記3 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%則記4 分；染色情況，無(wú)著色記0 分，淡黃色記1 分，棕黃色記2 分，褐色記3 分。將上述得分相乘，若結(jié)果為0 分則為陰性，1～4 分為弱陽(yáng)性，5～8 分為中陽(yáng)性，9～12 分則為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 臨床病理特征分析 統(tǒng)計(jì)所有患者的性別、年齡、分化程度、病理類型、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。1.5 觀察指標(biāo) 分析患者甲狀腺癌組織與配對(duì)癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，分析上述指標(biāo)與臨床病理特征的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯比甲狀腺癌旁組織高（P＜0.05）。見表1。

表1 甲狀腺癌組織及癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況對(duì)比[例（%）]

2.2 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床病理特征單因素分析 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），但可能與分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床病理特征的單因素分析[例（%）]

2.3 Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床病理特征多因素分析 多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高表達(dá)與甲狀腺癌低分化、髓樣癌、Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)性（OR＞1，P＜0.05）。見表3 至表5。

表3 賦值表

表4 Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床病理特征的多因素分析

表5 CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床病理特征的多因素分析

3 討論

甲狀腺癌是我國(guó)發(fā)病率增長(zhǎng)速度較快的惡性腫瘤之一，隨著腫瘤的不斷增長(zhǎng)，可能壓迫或侵犯鄰近器官或組織，導(dǎo)致患者出現(xiàn)呼吸困難、吞咽困難等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的正常生活質(zhì)量及生命安全。臨床有研究表明，Akt、CCND1 通路異常表達(dá)與細(xì)胞的增殖與凋亡等諸多生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7～8]。因此，分析Akt、CCND1 蛋白通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性具有重要意義。

Akt 為組織蛋白激酶B，其在磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）下游被激活，也是細(xì)胞存活與增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，可經(jīng)磷酸化多種底物發(fā)揮重要作用[9]。CCND1 屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族，其成員在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)具有顯著的蛋白質(zhì)豐度周期性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）。同時(shí)，該細(xì)胞周期蛋白與CDK4 或CDK6 形成的復(fù)合物能夠?qū)唵挝黄鸢l(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。有研究表明，CCND1 蛋白與腫瘤抑制蛋白R(shí)b 相互作用，該基因在發(fā)生突變、擴(kuò)增與過(guò)表達(dá)時(shí)可能會(huì)改變細(xì)胞周期的進(jìn)程，且利于腫瘤的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯比甲狀腺癌旁組織高，提示甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白陽(yáng)性過(guò)表達(dá)。分析原因可能是，Akt 在與細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇相結(jié)合后可在細(xì)胞膜上聚集，經(jīng)活化后形成p-Akt 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)，可作用于Akt 下游基因。p-Akt 可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白與信號(hào)通路的作用，且能夠阻滯細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞的存活，再經(jīng)下游分子缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管的形成[12]。裴小娟等[13]采用組織芯片免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)p-Akt、c-Myc、E-cad 及VEGF 在甲狀腺癌中的臨床表達(dá)，分析其病理意義，發(fā)現(xiàn)p-Akt 的陽(yáng)性高表達(dá)可能參與甲狀腺癌的發(fā)生，且與調(diào)控腫瘤新生血管有關(guān)，這與本研究結(jié)果近似。

本研究進(jìn)一步行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示低分化甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較中/ 高分化高，髓樣癌甲狀腺癌Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較濾泡癌及乳頭狀癌高，Ⅲ～Ⅳ期甲狀腺癌Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較Ⅰ～Ⅱ期高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高，提示Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有一定關(guān)系。分析原因，Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白在特殊的環(huán)境或疾病影響下被激活，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力加強(qiáng)，可提高甲狀腺癌的發(fā)生率，且增加腫瘤的惡性程度，加快病情進(jìn)展。前者可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等參與甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展；后者可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并能夠通過(guò)激活G1期特有蛋白CDK4 致使細(xì)胞周期異常，促成腫瘤細(xì)胞增殖等[14～15]。陳志峰等[16]通過(guò)對(duì)86 例甲狀腺癌患者癌組織與癌旁組織中Akt/CCND1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者癌組織Akt、CCND1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，且與臨床病理特征（分期、分化程度、病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）密切相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，Akt、CCND1 通路相關(guān)蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁組織高，且與臨床病理特征（分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）有一定關(guān)系。