姚晰晨，高愛(ài)社，田浩，張振強(qiáng)，宋軍營(yíng)，陳芳（.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 45008；.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 45008）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的退行性病變，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知水平下降、記憶減退和行為障礙等[1]。我國(guó)60 歲以上人群AD 的患病率約為3.9%，約占我國(guó)癡呆總患病率的65%，但隨著社會(huì)老齡化繼續(xù)發(fā)展，這一數(shù)據(jù)還將逐漸遞增，對(duì)社會(huì)及患者家屬造成沉重的壓力[2]。從組織病理學(xué)上看，AD 以β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）蓄積形成的老年斑、Tau蛋白磷酸化、神經(jīng)元纖維纏繞（neurofibrillary tangles，NFTs）、神經(jīng)血管功能異常、神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡為其主要特征[3]。這些病理改變與血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的破壞密切相關(guān)[4]，BBB是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)跨膜緊密連接蛋白相互連接構(gòu)成的一層特殊的致密結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)的完整性可以降低循環(huán)血液中有害物質(zhì)對(duì)腦組織的傷害，BBB功能障礙被認(rèn)為是AD 發(fā)生發(fā)展的先兆，對(duì)于AD 的發(fā)展進(jìn)程具有重要意義[5]。在AD 患者的大腦內(nèi)，緊密連接蛋白表達(dá)下降或超微結(jié)構(gòu)破壞會(huì)導(dǎo)致BBB 的完整性和功能活性受損[6]。BBB 功能異常會(huì)觸發(fā)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，增強(qiáng)β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，并最終促進(jìn)Aβ 的生成[7]。而異常Aβ 沉積后可通過(guò)破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等途徑加重BBB 功能障礙，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。因此，通過(guò)保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白，維持BBB 的正常功能可能是改善AD 認(rèn)知功能障礙的有效途徑。

AD 屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”的范疇，多因氣血不足，腎精虧虛，痰瘀阻痹，漸使髓海不足、神機(jī)失用。丹萎片臨床用于治療胸痹，它來(lái)源于著名的中醫(yī)經(jīng)典《金匱要略》名方瓜蔞薤白白酒湯。根據(jù)“痰瘀互結(jié)”理論，國(guó)醫(yī)大師雷忠義研制了此方，該方具有寬胸散結(jié)、通陽(yáng)化痰、化瘀活血等功效[8]。本課題組[9]前期體外實(shí)驗(yàn)表明，丹蔞片醇提物具有保護(hù)BBB 緊密連接蛋白的作用，丹蔞片含藥血清能減輕Aβ1-40 誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究以SAMP8 小鼠作為AD 模型小鼠，探討丹蔞片是否可以通過(guò)增強(qiáng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)BBB 的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5 月齡SPF 級(jí)雄性SAMP8 快速衰老小鼠36 只，體質(zhì)量（35±3）g，同月齡SPF 級(jí)雄性SAMR1 正常老化小鼠12 只，北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0004；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：37009200004690。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：DWLL201904105。

1.2 藥物與試劑丹蔞片，吉林康乃爾藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20190107；多奈哌齊，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1701069。參照陳奇主編的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（第3 版）計(jì)算給藥劑量，丹蔞片的給藥劑量按60 kg 成人1 日用藥量進(jìn)行換算，成人丹蔞片用量為0.075 g·kg-1·d-1，經(jīng)體表面積折算后，小鼠等效劑量為1.350 g·kg-1·d-1，多奈哌齊給藥劑量為0.747 mg·kg-1·d-1。Occludin 抗體，英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab216327；ZO-1 抗體，美國(guó)Boster 公司，批號(hào)：A00513-1；Claudin-5 抗體，美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：PA5-30193；Gapdh 抗體，美國(guó)Boster公司，批號(hào)：A00227；MMP-9 抗體，美國(guó)Boster公司，批號(hào)：3852S。

1.3 儀器Morris 水迷宮，深圳瑞沃德生命科技有限公司；Y 迷宮，深圳瑞沃德生命科技有限公司；JEM1400 透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；AL204 型萬(wàn)分之一精密電子秤，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；KZ-III-F 型高速低溫組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；Mini-ProteanTetra 型電泳轉(zhuǎn)膜儀、Mini-PROTEAN 型自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.4 動(dòng)物模型、分組和給藥SAMP8 小鼠可表現(xiàn)出AD 發(fā)病機(jī)制中大部分特征，如BBB 的破壞、認(rèn)知記憶功能下降等，因此SAMP8 小鼠常作為經(jīng)典AD 模型小鼠[10]。SAMR1 小鼠的生理過(guò)程與其他品系的正常小鼠相似，一般作為SAMP8 小鼠的正常對(duì)照[11]。選取5 月齡SPF 級(jí)雄性SAMP8 小鼠36 只，隨機(jī)分為3 組：模型組、丹蔞片組和多奈哌齊組（陽(yáng)性對(duì)照組），每組12 只。另以12 只同月齡SAMR1 小鼠設(shè)為正常對(duì)照組。各給藥組按上述劑量給藥，正常組和模型組給予同等體積生理鹽水灌胃，灌胃體積為10 mL·kg-1，每日1 次，共灌胃8 周。

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃2 月結(jié)束前1 周進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)[12-13]。于測(cè)試前1 d 進(jìn)行初篩，剔除不合格小鼠。進(jìn)行為期5 d 定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在60 s 內(nèi)尋找平臺(tái)時(shí)間（逃避潛伏期）。在實(shí)驗(yàn)第6 天撤除平臺(tái)，自由游泳60 s 測(cè)試空間探索能力。記錄小鼠在各象限停留的時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.6 Y 迷宮實(shí)驗(yàn)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第二天進(jìn)行Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。在Y 迷宮三個(gè)臂的交匯處將小鼠朝著同一個(gè)方向放入，自由活動(dòng)5 min，記錄小鼠總進(jìn)臂次數(shù)及進(jìn)臂順序。根據(jù)小鼠總進(jìn)臂次數(shù)及準(zhǔn)確交替次數(shù)，得出自發(fā)交替準(zhǔn)確率，計(jì)算公式為：自發(fā)交替準(zhǔn)確率=（總的正確進(jìn)臂順序/總進(jìn)臂次數(shù)－2）×100%[14]。其中，小鼠連續(xù)進(jìn)入3 個(gè)不同的臂視為準(zhǔn)確交替1 次，代入公式計(jì)算出各組小鼠自發(fā)交替準(zhǔn)確率。

1.7 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠海馬區(qū)腦微血管超微結(jié)構(gòu)每組隨機(jī)取3 只小鼠麻醉，斷頭取出小鼠海馬腦組織，于2.5%戊二醛固定液中4 ℃過(guò)夜；1%鋨酸固定1.5 h，丙酮梯度脫水，EPON812 樹(shù)脂包埋，干燥箱中梯度聚合；超薄切片（70 nm），撈于100 目銅網(wǎng)上，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛法染色，透射電鏡觀察。

1.8 Western Blot 法檢測(cè)各組小鼠Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 的表達(dá)水平每組取6 只小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出小鼠海馬組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取出海馬組織放入研磨管內(nèi)，加入適量RIPA 裂解液，研磨機(jī)粉碎后放入低溫離心機(jī)離心，離心半徑8.6 cm，4 ℃，15 000 r·min-1，10 min。離心后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，之后各組取20 μg 進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h，用PBST 稀釋一抗工作液：Claudin-5（1∶1 000）；Occludin（1∶1 000）；ZO-1（1∶1 000）；MMP-9（1∶1 000）。一抗孵育4 ℃過(guò)夜，用PBST 稀釋二抗（1∶1 000）；二抗為HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG，內(nèi)參為Gapdh（1∶5 000），使用ECL發(fā)光液顯影，以Las-4000 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行成像并分析數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD-t）檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 與正常組相比，模型組的平均逃避潛伏期在第4 天起開(kāi)始延長(zhǎng)（P＜0.01）。與模型組相比，丹蔞片組及多奈哌齊組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。在第6 天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)減少、目標(biāo)象限停留時(shí)間減少（P＜0.01），與模型組小鼠相比，丹蔞片組和多奈哌齊組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)均增加（P＜0.01，P＜0.05），目標(biāo)象限停留時(shí)間均增加（P＜0.05）。見(jiàn)表1 、表2 和圖1。

圖1 各組小鼠Morris 水迷宮檢測(cè)60 s 軌跡圖Figure 1 Trace for 60 s econds by Morris water maze detection in each group of mice

表1 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠定位航行能力的影響（±s，n=6）Table 1 Effect of Danlou Tablets on the ability of positioning navigation of SAMP8 mice（±s，n=6）

表1 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠定位航行能力的影響（±s，n=6）Table 1 Effect of Danlou Tablets on the ability of positioning navigation of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組丹蔞片組多奈哌齊組劑量/（g·kg-1·d-1）逃避潛伏期/s 5 d 37.55±1.24 48.00±3.28##38.11±3.24**38.52±1.64**--1.350 0.747×10-3 1 d 54.23±5.87 57.28±4.51 53.07±9.11 53.38±4.93 2 d 53.52±3.39 54.96±5.27 49.61±5.75 50.79±5.83 3 d 47.33±1.70 53.08±3.61 47.37±1.34 45.94±3.37 4 d 41.59±6.18 51.63±4.37##43.92±6.14*43.02±3.15*

表2 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠空間探索能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Danlou Tablets on the ability of spatial exploration of SAMP8 mice（±s，n=6）

表2 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠空間探索能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Danlou Tablets on the ability of spatial exploration of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

目標(biāo)象限停留時(shí)間/s 24.79±5.27 16.55±3.47##22.14±2.05*22.57±2.35*組別正常組模型組丹蔞片組多奈哌齊組劑量/（g·kg-1·d-1）--1.350 0.747×10-3跨越平臺(tái)/次2.56±0.68 1.22±0.63##2.33±0.67**2.22±0.63*

2.1.2Y 迷宮實(shí)驗(yàn) 與正常組相比，模型組小鼠的進(jìn)臂總次數(shù)和自發(fā)交替準(zhǔn)確率顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），與模型組小鼠相比，丹蔞片組和多奈哌齊組小鼠的進(jìn)臂總次數(shù)和自發(fā)交替準(zhǔn)確率均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠辨別學(xué)習(xí)參考能力的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Danlou Tablets on the discriminative learning ability of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：與正常組比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

劑量/（g·kg-1·d-1）自發(fā)交替準(zhǔn)確率/%48.00±9.35 27.63±6.28###44.14±8.53**44.57±6.46**組別正常組模型組丹蔞片組多奈哌齊組--1.350 0.747×10-3進(jìn)臂總次數(shù)/次38.00±4.36 27.50±4.65##34.33±2.29*35.33±3.59*

2.2 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠海馬區(qū)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響正常組小鼠海馬腦組織可見(jiàn)光滑完整的橢圓形毛細(xì)血管腔，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞緊密附著于血管腔周?chē)?，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接清晰可見(jiàn)。與正常組相比，模型組可見(jiàn)緊密連接間隙增寬，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)受損。與模型組相比，丹蔞片組和多奈哌齊組的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙緊密連接的膜結(jié)構(gòu)較清晰，少部分見(jiàn)到間隙略增寬。見(jiàn)圖2。

圖2 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠海馬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響Figure 2 Effect of Danlou Tablets on ultrastructural changes of tight junction of brain microvascular endothelial cells in hippocampal tissue of SAMP8 mice

2.3 丹蔞片對(duì)SAMP8 小鼠緊密連接蛋白及MMP-9表達(dá)的影響與正常組相比，模型組小鼠的緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達(dá)下降（P＜0.05），MMP-9 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，丹蔞片組小鼠的Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），而MMP-9 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；多奈哌齊組小鼠的Claudin-5、ZO-1 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），MMP-9 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組小鼠海馬組織Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)Figure 3 The protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in the hippocampal tissue of mice in each group

表4 丹蔞片對(duì)各組小鼠海馬組織Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Danlou Tablets on the protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in hippocampal tissue of mice in each gruop（±s，n=6）

表4 丹蔞片對(duì)各組小鼠海馬組織Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Danlou Tablets on the protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in hippocampal tissue of mice in each gruop（±s，n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

MMP-9 1.06±0.03 1.33±0.05##1.09±0.05*1.06±0.09**組別正常組模型組丹蔞片組多奈哌齊組劑量/（g·kg-1·d-1）--1.350 0.747×10-3 Claudin-5 1.35±0.07 0.82±0.06#1.27±0.06*1.23±0.16*Occludin 1.73±0.05 1.38±0.09#1.68±0.05*1.45±0.08 ZO-1 1.91±0.17 1.40±0.06#1.61±0.05*1.45±0.11**

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BBB 的損傷在AD 的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。Zlokovic 等[15]首次提出AD 神經(jīng)血管假說(shuō)，Aβ 在BBB 中存在清除缺陷，腦血管系統(tǒng)衰老和新生血管形成的改變可能導(dǎo)致神經(jīng)血管解偶聯(lián)、血管退化、腦慢性低灌注和神經(jīng)血管炎癥，這些事件將導(dǎo)致BBB 的破壞，大腦內(nèi)環(huán)境平衡的失調(diào)以及突觸和神經(jīng)元功能衰退，最終將導(dǎo)致認(rèn)知功能的障礙[16]。因此，降低腦微血管通透性，加速清除Aβ，改善腦部的微環(huán)境，保護(hù)BBB 功能可能是改善AD 認(rèn)知功能的關(guān)鍵。BBB 不是一個(gè)獨(dú)特的組成部分，而是由緊密連接、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞末端足突形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[17]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白相互聯(lián)系構(gòu)成BBB的基本骨架[18]。緊密連接蛋白是一種位于頂端膜附近的多分子復(fù)合物，由跨膜蛋白（Claudins、Occludins）和連接黏附分子（JAM）組成，它們是緊密連接蛋白通透性的主要決定因素，通過(guò)支架蛋白（ZO-1）等連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，將其定位在細(xì)胞膜上，對(duì)于保持BBB 的完整性至關(guān)重要[19]。Claudin-5 是Claudins 家族的重要成員之一，在一項(xiàng)敲除小鼠基因的研究中，下調(diào)Claudin-5 可引起B(yǎng)BB 的特異性滲漏，突出了其在BBB 功能中的重要性[20]。Occludin是一種跨膜蛋白，通過(guò)同型相互作用以增加跨內(nèi)皮電阻（Transendothelial electrical resistance，TEER），對(duì)控制腦組織的鈣離子濃度的穩(wěn)定起重要作用，可以降低細(xì)胞損傷[21]。ZO-1 是具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)輔助蛋白，參與緊密連接蛋白的形成，ZO-1 和其他家族成員將包括Claudins，Occludin 和JAM 在內(nèi)的跨膜蛋白與其他細(xì)胞質(zhì)蛋白和肌動(dòng)蛋白微絲相連，對(duì)BBB 的完整性具有重要作用[22]。AD 發(fā)生時(shí)常伴隨著Claudins 及ZO-1、Occludin 等多種緊密連接蛋白的喪失及分布異常，神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷，星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度誘導(dǎo)，以及BBB 通透性增加[23]。在AD 患者大腦中，Aβ 被證明可誘導(dǎo)緊密連接蛋白（Claudin-5，ZO-1，Occludins）的變化，導(dǎo)致AD 患者的屏障功能障礙和血管通透性增加[24]。在基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中，基質(zhì)金屬肽酶9（MMP-9）是與AD 及BBB 相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。既往研究[25]表明，MMP-9 可以降解血管內(nèi)皮基底層和緊密連接蛋白，從而破壞BBB 的完整性。中藥白藜蘆醇對(duì)AD 大鼠BBB 完整性的保護(hù)作用是通過(guò)降低MMP-9 的表達(dá)以及增加Claudin-5的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[26]。另一項(xiàng)研究[27]發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)AD 患者的腦脊液血漿發(fā)現(xiàn)MMP-9 水平明顯升高，表明MMP-9 可能會(huì)增加BBB 的通透性、激活炎癥因子，并加速AD 的發(fā)展進(jìn)程。而缺氧復(fù)氧模型誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)BBB 的破壞作用與MMP-9 的表達(dá)增加有關(guān)，MMP-9 主要通過(guò)緊密連接蛋白如ZO-1，Occludin 和Claudin-5 的降解來(lái)增加表達(dá)，進(jìn)而干擾BBB 的完整性[28]，表明可以通過(guò)抑制MMP-9 的表達(dá)來(lái)減少緊密連接蛋白的損失，從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)BBB 的目的。

丹蔞片主治痰瘀互結(jié)之證，可通過(guò)調(diào)控不同生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮活血化瘀、抗炎降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[29]。該方中君藥為薤白和瓜蔞，可寬胸散結(jié)，化瘀通陽(yáng)；赤芍和丹參可通絡(luò)活血；葛根和黃芪升舉陽(yáng)氣，補(bǔ)氣健脾行血；澤瀉可利水滲濕；具有引經(jīng)功效的郁金、川芎和丹參專(zhuān)入心肝二經(jīng)，活血化瘀，理氣養(yǎng)血。全方寬胸通陽(yáng)，化痰散結(jié)，活血化瘀，乃瘀血阻痹，腦脈不通之良方，可用于治療AD[30-31]。藥理學(xué)研究[32]表明，丹蔞片有促進(jìn)微循環(huán)、降低血脂水平及治療動(dòng)脈粥樣硬化等作用。

衰老加速小鼠（SAM）是最初從AKR/J 小鼠開(kāi)發(fā)的近交系小鼠，SAMP8 小鼠是AD 的理想動(dòng)物模型[33]。本實(shí)驗(yàn)選取5 月齡SAMP8 和SAMR1 小鼠，灌胃2 個(gè)月給藥后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶和工作記憶能力。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組小鼠相比，快速老化SAMP8 小鼠在Morris 水迷宮和Y 迷宮中均表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶衰退和工作記憶下降，而經(jīng)過(guò)丹蔞片進(jìn)行干預(yù)后，學(xué)習(xí)記憶能力和工作記憶能力有所提高，認(rèn)知功能障礙有所改善。電鏡結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組緊密連接間隙增寬，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)受損。丹蔞片干預(yù)后，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接間隙整體變小，膜結(jié)構(gòu)較清晰，部分恢復(fù)正常。Western Blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAMP8 小鼠在7 月齡時(shí)出現(xiàn)緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達(dá)減少，而丹蔞片干預(yù)后能夠抑制MMP-9 的表達(dá)，減少SAMP8 小鼠的緊密連接蛋白丟失，結(jié)合行為學(xué)結(jié)果，提示丹蔞片能改善SAMP8 小鼠的認(rèn)知障礙及記憶能力，其作用機(jī)制可能與抑制MMP-9 的表達(dá)，減少緊密連接蛋白丟失，維護(hù)BBB 功能有關(guān)。