孫亦鵬，倪振華，劉金金，王雄彪（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。大氣污染是哮喘發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，其不僅可誘發(fā)和加重哮喘的癥狀、降低肺功能、提高住院率[3]，還可導(dǎo)致哮喘患者出現(xiàn)激素抵抗[4]。苯并芘（BaP）是大氣污染物中常見的、毒性最大的物質(zhì)之一[5]。BaP 暴露可顯著增加兒童的哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)[6]，還可誘導(dǎo)哮喘模型肺組織中白細(xì)胞介素4（IL-4）和白細(xì)胞介素13（IL-13）的分泌，加劇氣道高反應(yīng)性[7-10]。本課題組前期研究[11]也發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏液分泌增加。因此，以BaP 為代表的大氣污染物可通過誘導(dǎo)炎癥浸潤和黏液分泌加劇哮喘肺損傷。而目前尚缺乏針對(duì)大氣污染誘發(fā)和加重哮喘的有效治療方案。芪仙湯是本課題組王雄彪教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的自擬方，臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均顯示其具有良好的抗哮喘作用[12-15]。體外實(shí)驗(yàn)[16]發(fā)現(xiàn)，芪仙湯提取物可下調(diào)BaP 誘導(dǎo)的氣道黏蛋白5AC（MUC5AC）高表達(dá)。然而在動(dòng)物體內(nèi)，芪仙湯能否改善BaP 誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥浸潤和黏液分泌尚不清楚。因此，本研究擬以卵蛋白（OVA）致敏法復(fù)制哮喘小鼠模型，以BaP 暴露法模擬大氣污染，觀察芪仙湯對(duì)BaP 加劇哮喘小鼠氣道炎癥和黏液分泌的影響，以及對(duì)活性氧（ROS）和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白的作用，以期闡釋其抗肺損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物4 周齡雌性BALB/c 小鼠40 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2018-0032。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批文號(hào)：DWEC-A-201804001。

1.2 藥物及制備芪仙湯由黃芪30 g、仙靈脾30 g、巴戟天30 g、虎杖30 g、川芎15 g、旋覆花9 g、枇杷葉30 g、生地黃30 g 組成，購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，所有藥材經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥學(xué)部袁易主任藥師鑒定均為正品。芪仙湯按常規(guī)方法煎煮，水煎液過濾、濃縮至含生藥1.5 g·mL-1，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑OVA（批號(hào)：9006-59-1）、硫酸鋁鉀（批號(hào)：7784-24-9）、BaP（批號(hào)：B1760），均購自美國Sigma 公司；HE 染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C0105S；RNA 提取試劑盒，美國Zymo Research 公司，批號(hào)：R2052；TRIzol 試劑盒（批號(hào)：9109）、PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR047）、TB Green PCR 反應(yīng)液（批號(hào)：RR420），均購自日本Takara 公司；AB-PAS 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1285；MUC5AC 抗體，美國Abcam 公司，批號(hào)：ab79082；p-ERK 抗體，美國CST 公司，批號(hào)：4370；兔IgG 免疫組化試劑盒，武漢博士德公司；ROS 檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程公司，批號(hào)：E004-1-1。致敏液：將10%硫酸鋁鉀溶液與500 μg·mL-1的OVA 溶液等比例混勻，用氫氧化鈉溶液將pH 值調(diào)至6.5，室溫下靜置1 h，離心、棄上清，在余下沉淀中加入生理鹽水至初始體積即得；激發(fā)液：2 mg·mL-1的OVA 溶液。

1.4 主要儀器EG1150 型石蠟組織包埋機(jī)、RM2335型病理切片機(jī)、ST5010 型病理染色機(jī)、CV5030 型全自動(dòng)玻璃蓋片機(jī)，德國Leica 公司；BX43 型顯微鏡，日本Olympus 公司；T100 型梯度PCR 儀器，美國伯樂公司；ViiA7 型Real-time PCR 擴(kuò)增儀，美國Applied Biosystems 公司；Countess 3 型全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Varioskan LUX 型多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.5 模型復(fù)制、分組、給藥及樣本采集小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將其隨機(jī)分為：空白組、哮喘組（OVA）、BaP 組（OVA+BaP）和芪仙湯組（OVA+BaP+芪仙湯37.5 g·kg-1），每組10 只。OVA 致敏小鼠于第1 天和第15 天腹腔注射致敏液200 μL，并于第15、26、27、28 天麻醉后滴鼻激發(fā)液50 μL，空白組用生理鹽水作為對(duì)照[17]。BaP 暴露小鼠于第16 天開始滴鼻BaP 溶液30 μL（320 μmol·L-1），每2 日1 次，共7 次[18]。按照人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量確定小鼠每日芪仙湯的給藥劑量為37.5 g·kg-1；芪仙湯組小鼠于第16 天開始灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)13 d，灌胃前將藥液加熱至37 ℃；其他各組用生理鹽水灌胃。于第28 天取材，眼球失血法處死小鼠，剪去雙側(cè)肺外緣肺泡組織約2 mm，將左肺用福爾馬林固定以行病理染色；右肺尖葉和心葉用于ROS 檢測(cè)，右肺膈葉和中間葉用于RNA 提取。空白組、哮喘組、BaP 組和芪仙湯組未完成全程實(shí)驗(yàn)的小鼠數(shù)量分別為1、2、4、2 只。

1.6 HE 染色法檢測(cè)肺組織病理形態(tài)學(xué)變化左肺標(biāo)本經(jīng)固定后，組織脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、烤片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察，并對(duì)肺組織炎癥浸潤程度進(jìn)行評(píng)分[19]。

1.7 AB-PAS 染色法檢測(cè)肺組織黏液分泌小鼠左肺切片脫蠟至水，蒸餾水洗2 min；阿利新藍(lán)染色20 min，蒸餾水洗3 次，每次2 min；滴加氧化劑5 min，蒸餾水浸洗2 次；Schiff Reagent 浸染20 min，自來水流水沖洗10 min；蘇木素染核5 min，水洗；酸性分化液分化2 s，水洗；Scott 藍(lán)化液返藍(lán)，水洗3 min；室溫下晾干，二甲苯透明，封片；鏡下觀察、拍照，采用Image Pro Plus 軟件測(cè)量黏液陽性區(qū)域面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 免疫組化法檢測(cè)肺組織MUC5AC、p-ERK 蛋白表達(dá)小鼠左肺切片經(jīng)過烤片、脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)10 min，用PBS 沖洗3 次。5% BSA 封閉30 min，滴加一抗，置于4 ℃冰箱內(nèi)，過夜。第2 天，PBS 沖洗3 次，滴加兔IgG 二抗，37 ℃下孵育60 min，PBS 沖洗3 次；滴加SABC 50 μL，37 ℃下孵育20 min，PBS 沖洗3 次；DAB染色，蘇木素染核；鏡下觀察、拍照，采用Image Pro Plus 軟件計(jì)算積分光密度（IOD）值，并測(cè)量面積（Area），以IOD/Area 值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 qRT-PCR 法檢測(cè)肺組織IL-4、IL-13 mRNA表達(dá)取適量小鼠右肺組織，按RNA 提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，檢測(cè)RNA 濃度、純度。采用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保持。然后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、5 s，95 ℃、30 s，60 ℃、34 s，共40 個(gè)循環(huán)。分析擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct 值；以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組間目的基因的表達(dá)水平差異。引物合成由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tabel 1 Primer sequences for PCR

1.10 DCFH-DA 探針法檢測(cè)肺組織ROS 水平將新鮮右肺組織剪成1 mm3大小的組織塊，在37 ℃下酶解25 min 后，用尼龍網(wǎng)收集單細(xì)胞懸浮液；將細(xì)胞重懸于含有DCFH-DA（10 μmol·L-1）的PBS 中，37 ℃下孵育30 min；然后用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長525 nm 下檢測(cè)，所得光密度（OD）值即作為熒光強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織炎癥的影響結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，與空白組比較，哮喘組小鼠的氣道、血管周圍炎癥細(xì)胞明顯增多，氣道黏膜出現(xiàn)中斷、不連續(xù)，炎癥評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤進(jìn)一步加劇，肺泡間隔斷裂明顯，炎癥評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤、氣道黏膜連續(xù)性均明顯改善，炎癥評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯能夠減輕BaP 暴露哮喘模型小鼠的肺組織炎癥。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果（HE 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 1 Results of HE staining in lung tissue of mice in different groups（HE staining，×200；±s，n=6-9）

2.2 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。與空白組比較，哮喘組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)具有抑制作用。

圖2 各組小鼠肺組織的IL-4、IL-13 mRNA 表達(dá)（±s，n=6～9）Figure 2 The mRNA expressions of IL-4 and IL-13 in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.3 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏液分泌的影響結(jié)果見圖3。與空白組比較，哮喘組小鼠的氣道黏液分泌顯著增多（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠的氣道黏液顯著增多（P＜0.01）；與BaP組比較，芪仙湯組小鼠的氣道黏液分泌顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏液分泌具有抑制作用。

圖3 各組小鼠肺組織黏液分泌染色情況（AB-PAS 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 3 The mucus secretion in lung tissue of mice in different groups（AB-PAS staining，×200；±s，n=6-9）

2.4 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道MUC5AC蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4。與空白組比較，哮喘組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏蛋白表達(dá)具有抑制作用。

圖4 各組小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達(dá)情況（免疫組化，×400；±s，n=6～9）Figure 4 The protein expression of MUC5AC in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

2.5 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織ROS 的影響結(jié)果見圖5。與空白組比較，哮喘組小鼠肺組織ROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠肺組織ROS 水平顯著升高（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠肺組織ROS 水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其降低ROS 水平有關(guān)。

圖5 各組小鼠肺組織的ROS 水平（±s，n=6～9）Figure 5 Detection of ROS content in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.6 芪仙湯對(duì)BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道p-ERK 表達(dá)的影響結(jié)果見圖6。與空白組比較，哮喘組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其抑制ERK 通路有關(guān)。

圖6 各組小鼠肺組織p-ERK 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400；±s，n=6～9）Figure 6 The protein expression of p-ERK in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

3 討論

中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為大氣污染病邪性質(zhì)當(dāng)屬污穢之氣、陰邪、霧露兼夾污濁[20]。蒼天之氣，清凈則志意治，外邪犯肺，肺氣消散不及，邪毒壅塞于肺，阻滯氣機(jī)，發(fā)為哮病[21]，故污穢之氣與哮病密切相關(guān)。且肺朝百脈，污穢之氣久侵肺臟，日久而致肺氣不足，無力行血，則血液瘀滯，肺氣不得肅降發(fā)為哮??；外邪不能獨(dú)傷人，必因正氣不足，無力抵御污穢之氣。肺主呼氣，腎主納氣，腎虛無以納氣則喘；脾胃虛弱，土不生金，則肺失所養(yǎng)，脾腎虛弱可導(dǎo)致哮病[22]。因此，可將“污穢之氣”歸結(jié)為誘發(fā)哮病的外因，而“脾腎陽虛”則歸結(jié)為內(nèi)因。故中醫(yī)治療大氣污染誘發(fā)的哮喘應(yīng)以“補(bǔ)益脾腎、化瘀祛邪”之法。芪仙湯是由“二仙湯”化裁而來的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)益脾腎，活血化瘀之功效，對(duì)治療大氣污染相關(guān)哮喘具有理論依據(jù)。

氣道炎癥是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制之一，BaP 能通過多種誘導(dǎo)炎癥機(jī)制加劇哮喘的肺損傷。研究發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導(dǎo)OVA 小鼠血液中產(chǎn)生更多的IgE 及嗜酸性粒細(xì)胞，并在肺部組織中分泌多種炎癥細(xì)胞因子[8-10]；可增強(qiáng)骨髓中樹突狀細(xì)胞抗原提呈能力[7]；可誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和NK-T 細(xì)胞在肺組織中浸潤[18]，從而加劇哮喘的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，芪仙湯可抑制BaP 加劇的哮喘小鼠肺部炎癥，抑制Th2 型細(xì)胞因子的分泌。

黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理學(xué)改變，是哮喘病情惡化的重要原因[23]。黏蛋白是黏液的主要組成部分，其中MUC5AC 與哮喘關(guān)系最密切，基因敲除MUC5AC 不僅可抑制哮喘氣道炎癥，還可緩解哮喘的氣道高反應(yīng)[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC 表達(dá)量增加[11]，而芪仙湯提取物可抑制BaP 誘導(dǎo)的MUC5AC 表達(dá)上調(diào)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪仙湯對(duì)BaP 誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道黏液分泌具有顯著改善作用，并能抑制小鼠氣道黏蛋白表達(dá)。研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，中藥地黃中的梓醇和虎杖中的白藜蘆醇均可抑制哮喘小鼠黏液分泌，抑制MUC5AC 表達(dá)，芪仙湯的藥理作用可能與此有關(guān)。

氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，也是大氣污染加劇哮喘的原因之一。大氣污染物可抑制哮喘小鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，從而提高ROS 水平[27]。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，在BaP 誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞MUC5AC 高表達(dá)的機(jī)制中與線粒體ROS 有關(guān)，而白藜蘆醇可抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生。此外，多種中藥單體均具有抗氧化作用，如川芎嗪可通過提高SOD 水平抑制ROS 的產(chǎn)生[28]；黃芪甲苷Ⅳ可通過抑制線粒體鈣超載降低線粒體ROS 水平[29]；淫羊藿苷可抑制細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生，從而緩解順鉑的細(xì)胞毒性[30]。本研究結(jié)果表明，芪仙湯可抑制BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織中ROS產(chǎn)生，可能與芪仙湯含有上述抗氧化活性成分有關(guān)。

ERK 是信號(hào)通路中的重要激酶，可調(diào)節(jié)人體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過程。ERK 通路的過度激活可導(dǎo)致癌癥、炎癥等多種疾病[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，ERK 通路在哮喘模型小鼠肺組織內(nèi)異常激活，抑制ERK 通路可顯著減弱其肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、黏液產(chǎn)生、炎癥因子釋放、氣道平滑肌收縮和氣道高反應(yīng)性。本研究也發(fā)現(xiàn)，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其抑制ERK 通路有關(guān)。

綜上所述，芪仙湯能夠改善大氣污染物BaP 加劇的哮喘肺部炎癥、黏液分泌，具有較好的抗肺損傷作用，其機(jī)制可能與抑制ROS 及ERK 通路有關(guān)。