潘艷伶，陳洪民，伏紅穎，楊紅，凌湘力（.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004）

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要因素。近年研究[1]表明，DN 的發(fā)病機(jī)制可能與炎癥、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂等有關(guān)。在臨床上糖尿病一旦引發(fā)腎臟損傷，即使采取綜合治療，將血糖、血壓、血脂等控制在理想范圍內(nèi)，仍不能阻止DN 的持續(xù)性惡化[2]。因此探尋有效治療靶點(diǎn)，對(duì)DN 進(jìn)行積極防治具有重要意義。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）與DN 密切相關(guān)，是其發(fā)病的核心因子，可通過(guò)活化Smad 信號(hào)通路，刺激細(xì)胞外基質(zhì)聚集和生成，最終導(dǎo)致腎小球硬化，加速DN 進(jìn)展[3]。而MicroRNA-21（miRNA-21）是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平的相關(guān)因子，可通過(guò)影響腎小球內(nèi)皮新生細(xì)胞的形態(tài)、腎小球?yàn)V過(guò)膜屏障完整性等促進(jìn)蛋白尿、管型尿等的發(fā)生，加劇DN 病情的惡化[4]。其在導(dǎo)致DN 腎臟損傷，影響腎功能過(guò)程中起著重要作用，有望成為治療DN 的新靶點(diǎn)。且有研究[5-6]證明，miRNA-21 與TGF-β1/Smad3 通路存在聯(lián)系，在糖尿病狀態(tài)下，miRNA-21 參與TGF-β1/Smad3 通路誘導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化損傷，影響腎臟功能。

全國(guó)名中醫(yī)凌湘力教授根據(jù)DN 氣陰兩虛、痰瘀濁毒阻絡(luò)的病機(jī)，創(chuàng)制了經(jīng)驗(yàn)方“糖通飲”。該方可以保護(hù)DN 患者腎功能，且在減輕蛋白尿、改善糖脂代謝方面具有一定優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床取得較好療效[7]，但作用機(jī)制尚不清楚。故本研究擬基于miRNA-21/TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探討糖通飲對(duì)DN大鼠的腎臟保護(hù)作用，以期進(jìn)一步明確其防治DN 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康雄性SD 大鼠60 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（180±20）g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：210726201100220348，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：2000575。

1.2 藥物及試劑糖通飲顆粒制劑，廣東一方制藥公司，批號(hào)：2011273；厄貝沙坦片，長(zhǎng)春修正藥業(yè)集團(tuán)公司，批號(hào)：210805。高脂高糖飼料（常規(guī)飼料58%、精煉豬油20%、蔗糖20%、膽固醇2%），長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技公司，批號(hào)：20210922；鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：V 900890；0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、過(guò)碘酸雪夫氏（PAS）染色試劑盒，北京索萊寶科技公司，批號(hào)：C1013、G1120、G1281；兔抗TGF-β1單克隆抗體、兔抗Smad2 單克隆抗體、兔抗Smad3 單克隆抗體，英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：EPR18163、EP784Y、EP568Y；兔抗p-Smad3 單克隆抗體、兔抗p-Smad2 單克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)：#3108、#9520；抗Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）單克隆抗體，武漢三鷹生物技術(shù)公司，批號(hào)：22734-1-AP；血糖試紙，美國(guó)強(qiáng)生公司，批號(hào)：4720780；空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯檢測(cè)試劑，德國(guó)Roche 公司，批號(hào)：61397401、63750501、62531101、64336501、60813801；尿蛋白定量試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C035-2-1；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 熒光定量試劑盒，上海翊圣生物科技公司，批號(hào)：11141ES10、1184ES25；miRNA 熒光定量PCR 試劑盒，廣州銳博生物技術(shù)公司，批號(hào)：R11068.5；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0010S。

1.3 主要儀器穩(wěn)豪倍易型血糖儀，美國(guó)強(qiáng)生公司；Cobas c702 型全自動(dòng)生化分析儀，德國(guó)Roche 公司；1730R 型高速冷凍離心機(jī)，上海貝晶生物技術(shù)公司；TGL-20M 型高速冷凍離心機(jī)，湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器公司；Tanon-5200 型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技公司；CFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；HistoCore 切片機(jī)，德國(guó)Leica 公司；BX53 型生物顯微鏡，日本OLYPUMS 公司；WD-2102B 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、DYCZ-24DN 型迷你雙垂直電泳儀、DYCZ-40D 型迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，北京六一生物科技公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥60 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)抽取10 只作為正常組，其余50 只作為造模組，進(jìn)行DN 模型復(fù)制。正常組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)；8 周后所有大鼠禁食不禁水12 h，對(duì)造模組大鼠給予含1% STZ 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5），按20、25、30 mg·kg-1行腹腔注射，共3 次，每次間隔72 h；正常組則注射相應(yīng)劑量的檸檬酸鈉緩沖液。于末次注射72 h 后檢測(cè)大鼠空腹血糖3 次（每次間隔24 h），若空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，且伴有明顯的飲水量和尿量增加，則判定大鼠2 型糖尿病模型復(fù)制成功。

高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)2 型糖尿病模型大鼠3 周后，轉(zhuǎn)移至代謝籠，收集24 h 尿液，24 h 尿蛋白定量≥30 mg，則判定DN 大鼠模型形成[8]。將50 只DN大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組（13.5 mg·kg-1，臨床等效劑量）及糖通飲低、中、高劑量組（6.21、12.42、24.84 g·kg-1，為臨床等效劑量的0.5、1、2 倍），每組10 只；灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)8 周；對(duì)照組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24 h 尿蛋白灌胃8 周后，代謝籠收集大鼠24 h 尿液，記錄各組大鼠24 h 尿液總量；將收集好的24 h 尿液以3 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照尿蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)595 nm、光徑1 cm、雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度，并按照說(shuō)明書(shū)方法計(jì)算24 h 尿蛋白定量。

1.6 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯水平給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，股動(dòng)脈取血，以3 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心10 min，取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯水平。

1.7 HE 及PAS 染色法觀察腎組織病理改變給藥結(jié)束后處死大鼠，取各組大鼠左腎置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h；經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋后制成4 μm 厚度的切片。將各組切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，分別嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行HE 及PAS 染色；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；于光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理改變。

1.8 RT-PCR 法檢測(cè)腎組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-III mRNA 表達(dá)水平取各組大鼠右腎組織0.05 g，TRIzol 法分離純化腎組織總RNA，檢測(cè)RNA 純度和含量；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min；用RT-PCR 試劑盒配制20 μL PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、15 min，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，循環(huán)40 次，單個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3 次。擴(kuò)增反應(yīng)后行熔解曲線分析，判斷產(chǎn)物是否有非特異性擴(kuò)增；分析擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct 值，以U6/GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。檢測(cè)miRNA-21 mRNA表達(dá)，以U6 作為內(nèi)參，引物由廣州RiboBio 公司設(shè)計(jì)合成；檢測(cè)TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參，引物均由上海Sangon 公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 The RT-PCR primer sequences

1.9 Western Blot 法檢測(cè)腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)取各組大鼠右腎組織0.1 g，加入500 μL 含有PMSF的RIPA 裂解緩沖液（含有1%磷酸酶抑制劑∶1%PMSF）進(jìn)行組織勻漿；以12 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心20 min，取上清；采用BCA 法檢測(cè)腎組織蛋白濃度。加入1.5×上樣緩沖液，煮沸后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用5 %脫脂牛奶封閉，1×TBST 洗膜后，分別孵育一抗GAPDH（1∶7 000）、TGF-β1（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、p-Smad2（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）、Col-Ⅲ（1∶1 000），4 ℃下過(guò)夜，洗滌；根據(jù)抗體的種屬特異性加入HRP 標(biāo)記的不同來(lái)源的二抗（1∶7 000），常溫下孵育1 h；采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，使用天能凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照；采用ImageJ 軟件對(duì)各蛋白條帶灰度值進(jìn)行半定量分析，以目的蛋白與GAPDH（內(nèi)參）的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖通飲對(duì)DN 大鼠一般情況的影響正常組大鼠反應(yīng)靈敏，皮毛、飲食、大小便均正常；模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，消瘦，毛色暗淡及多飲、多食、多尿表現(xiàn)。與模型組比較，給藥組大鼠普遍出現(xiàn)活動(dòng)增多，毛色較光亮，多飲、多食得到改善，以糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組改善明顯。結(jié)果表明，糖通飲能改善DN 大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食等一般情況。

2.2 糖通飲對(duì)DN 大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組的空腹血糖、24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，糖通飲各劑量組的空腹血糖、24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯水平均明顯降低（P＜0.05），且以糖通飲中、高劑量組降低更為明顯；厄貝沙坦組的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯無(wú)明顯變化（P＞0.05），其余指標(biāo)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，糖通飲在降低DN 大鼠血糖、血脂水平的同時(shí)，對(duì)其腎功能具有一定保護(hù)作用。

表2 糖通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Tangtong Drink on biochemical indicators in diabetic nephropathy model rats（±s，n=6）

表2 糖通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Tangtong Drink on biochemical indicators in diabetic nephropathy model rats（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

甘油三酯/（mmol·L-1）0.37±0.07 1.19±0.16*1.08±0.07#0.84±0.05#0.73±0.08#1.09±0.10組別正常組模型組糖通飲低劑量組糖通飲中劑量組糖通飲高劑量組厄貝沙坦組劑量/（g·kg-1）--6.21 12.42 24.84 13.5mg·kg-1空腹血糖/（mmol·L-1）5.20±0.69 30.20±2.52*26.70±2.07#23.33±1.36#22.20±1.70#26.00±1.79 24h 尿蛋白/mg 6.07±1.60 41.38±6.90*33.27±4.20#23.67±2.73#24.10±3.02#22.25±2.29#血尿素氮/（mmol·L-1）5.47±0.91 20.91±1.34*17.57±1.20#14.75±1.26#15.11±1.47#14.99±1.30#血肌酐/（μmol·L-1）12.17±3.60 58.00±6.63*39.83±4.26#28.33±2.50#29.17±3.66#28.67±3.56#總膽固醇/（mmol·L-1）1.01±0.16 2.16±0.16*1.85±0.07#1.62±0.08#1.60±0.09#2.06±0.17

2.3 糖通飲對(duì)DN 大鼠腎臟組織病理變化的影響HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1-A。正常組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組腎小球系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，腎小管萎縮，小管間質(zhì)間均可見(jiàn)有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。與模型組比較，各給藥組的腎小球和腎小管病變程度均出現(xiàn)減輕，且以糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組改善更明顯。

圖1 糖通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理變化的影響Figure 1 The effect of Tangtong Drink on renal histopathological changes in diabetic nephropathy model rats

PAS 染色結(jié)果見(jiàn)圖1-B。正常組PAS 陽(yáng)性染色物質(zhì)主要沿腎小球毛細(xì)血管壁及腎小管壁散在分布，其間并未出現(xiàn)陽(yáng)性物質(zhì)的沉積；模型組腎小球系膜區(qū)可見(jiàn)明顯陽(yáng)性物質(zhì)的沉積。與模型組比較，各給藥組PAS 陽(yáng)性染色物質(zhì)均有不同程度減少，其中以糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組改善更明顯。結(jié)果表明，糖通飲能有效改善DN 大鼠腎臟組織的病理變化。

2.4 糖通飲對(duì)DN 大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常組比較，模型組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腎臟組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較（±s，n=6）Figure 2 Comparison of relative mRNA expression levels of miRNA-21，TGF-β1，Smad2，Smad3 and Col-Ⅲin renal tissue among each group of rats（±s，n=6）

2.5 糖通飲對(duì)DN 大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s，n=6）Figure 3 Comparison of relative protein expression levels of TGF-β1，Smad2，Smad3，p-Smad2，p-Smad3 and Col-Ⅲin the renal tissue among each group of rats（±s，n=6）

3 討論

糖尿病腎?。―N）在臨床上主要表現(xiàn)為持續(xù)性的蛋白尿，而在病理上主要表現(xiàn)為腎小球肥厚、腎小球基底膜均質(zhì)性增厚[9]。DN 屬中醫(yī)“消渴”變證，按其臨床表現(xiàn)當(dāng)屬于消渴并“虛勞”“腎勞”“水腫”等范疇，中醫(yī)醫(yī)家大都認(rèn)為本病是肺、脾、腎三臟相干所致。全國(guó)名中醫(yī)凌湘力教授認(rèn)為，DN 作為中醫(yī)消渴久病引發(fā)的變證之一，是在氣陰兩虛為本的基礎(chǔ)上進(jìn)一步演變而來(lái)。因消渴日久耗傷氣陰，氣虛則推動(dòng)血液、津液運(yùn)行乏力，陰虛血虧則血行不暢，日久累聚成瘀，與痰濁膠結(jié)，久蘊(yùn)可生成熱毒，內(nèi)生諸邪阻滯腎絡(luò)，腎絡(luò)受阻，腎不藏精，精微下泄而出現(xiàn)蛋白尿；精微流失日久又加重氣陰耗傷，故DN 是虛實(shí)夾雜互損之復(fù)雜病證，其本為氣陰俱虛，其標(biāo)為痰瘀毒濁，病位在腎而涉及肝、脾。凌湘力教授根據(jù)DN 病機(jī)立法創(chuàng)制“糖通飲”[7]，方中君藥黃芪及臣藥生地黃、山藥、山萸肉培補(bǔ)肝腎、調(diào)養(yǎng)氣陰以固本虛；佐使藥以丹參、丹皮、地骨皮、茯苓、草決明、澤瀉入方，以求標(biāo)實(shí)痰瘀濁毒得除，腎絡(luò)得以疏通；諸藥合用具有益氣養(yǎng)陰保腎、清熱活血化痰泄?jié)嶂Γ窖a(bǔ)泄兼施，標(biāo)本同治。

現(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪的有效成分黃芪多糖、黃芪甲苷等能提高胰島素敏感性，雙向調(diào)節(jié)糖代謝，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡、抑制腎纖維化進(jìn)程等機(jī)制來(lái)發(fā)揮對(duì)DN 的治療作用[10]。生地黃的有效成分地黃多糖、梓醇等能有效降糖、降脂，改善胰島素抵抗[11]，并能減輕糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激損傷，減少TGF-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等加重腎臟負(fù)擔(dān)的因子表達(dá)[12]。山茱萸中的環(huán)烯醚萜苷能夠改善糖尿病血管病變大鼠的腎小球內(nèi)基質(zhì)增生、基底膜增厚，保護(hù)血管內(nèi)皮[13]。山藥所含山藥多糖亦被證實(shí)有顯著降糖作用，能改善糖耐量[14]。地骨皮及澤瀉具有良好的降血糖、降血脂作用[15-16]，且地骨皮中的有效成分甜菜堿、山柰酚能有效抑制腎小球系膜細(xì)胞異常增殖與細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度分泌，延緩腎小球硬化的發(fā)展[17]。茯苓多糖與丹參多酚酸鹽具有抑制腎間質(zhì)纖維化，延緩近端小管損傷，減少蛋白尿的作用[18-19]。丹皮及草決明的有效成分亦能通過(guò)抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的積累來(lái)延緩DN 進(jìn)程[20-21]。本研究結(jié)果亦表明，糖通飲能有效降低DN 大鼠尿蛋白，減輕腎臟損傷，保護(hù)腎功能，并同時(shí)具備降低血糖、血脂，改善其糖脂代謝的作用。

DN 的發(fā)病由諸多因子參與，TGF-β1被認(rèn)為是DN 發(fā)病過(guò)程中的中心環(huán)節(jié)，處于DN 相關(guān)生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)中心地位[22]。在DN 發(fā)生發(fā)展中，高糖、炎癥因子、氧化應(yīng)激等多種因素均可使TGF-β1激活并磷酸化與其具有高度親和力的Tβ2R 受體，并結(jié)合形成復(fù)合物；然后與Tβ1R 結(jié)合，其絲-蘇氨酸殘基區(qū)通過(guò)磷酸化被激活；活化的Tβ1R 與受體活化性Smad 蛋白2/3 結(jié)合，Smad2/3 磷酸化后再與Co-Smad（Smad4）結(jié)合形成低聚體復(fù)合物；經(jīng)過(guò)R-Smad—Co-Smad 模式轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，激活核內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分的啟動(dòng)因子成分，從而使細(xì)胞外基質(zhì)增加，使DN的腎臟病變呈進(jìn)行性發(fā)展[23]。研究[24]表明，TGF-β1與其下游的Smad2/3 在DN 模型動(dòng)物及DN 患者的腎小球、腎小管和腎小管間質(zhì)中的表達(dá)顯著上調(diào)。

miRNA-21 是一個(gè)特殊的miRNA，其差異性表達(dá)與腎臟的纖維化相關(guān)，其在正常腎臟組織中表達(dá)少，而在DN 模型動(dòng)物的腎小管間質(zhì)和腎小球纖維化區(qū)域皆高表達(dá)[25]，即DN 腎臟病變程度及腎功能損傷與miRNA-21 的表達(dá)呈正相關(guān)。有研究[26]證實(shí)，miRNA-21 基因缺失能夠保護(hù)DN 小鼠腎臟，抑制腎臟纖維化，保護(hù)其腎臟功能，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1及相關(guān)基質(zhì)蛋白有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，DN 大鼠腎臟組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)，TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)亦明顯上調(diào)。而與模型組比較，糖通飲給藥組大鼠腎臟組織miRNA-21、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-ⅢmRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)，TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)亦明顯下調(diào)。

綜上所述，糖通飲可能通過(guò)下調(diào)miRNA-21 的表達(dá)，抑制TGF-β1/Samd 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效降低細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性累積，從而改善DN 大鼠的腎臟損傷，保護(hù)其腎臟功能。