王燕茹　袁秉琛　孫郁婷　王志勇　虞道耿

關(guān)鍵詞：蝴蝶豆；相關(guān)性分析；主成分分析；隸屬函數(shù)；聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S541.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

世界上約20%的耕地屬于鹽堿地[1]。而土壤鹽度是降低植物生產(chǎn)力的主要非生物脅迫之一，因此人們生產(chǎn)耐鹽作物的必要性顯而易見(jiàn)[2]。目前篩選種植耐鹽植物是利用鹽堿地最科學(xué)高效的方式[3]。眾所周知，植物的耐鹽強(qiáng)弱一般隨不同物種和不同生長(zhǎng)階段而發(fā)生變化[4]。鹽脅迫條件下，植物最敏感的階段是芽期和苗期[5]。因而，對(duì)芽期或苗期的植物進(jìn)行耐鹽測(cè)試，能從大量材料中快速有效地篩選出耐鹽種質(zhì)。鹽害主要是土壤可溶性鹽分過(guò)高改變植物的細(xì)胞膜透性，使植物細(xì)胞失水，并阻礙植物進(jìn)行光合作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)不利[6-7]，嚴(yán)重時(shí)致死。

蝴蝶豆是豆科距瓣豆屬多年生纏繞性草本，具有根深、莖細(xì)、葉大、產(chǎn)量高不易木質(zhì)化等特點(diǎn)，年產(chǎn)鮮莖葉可達(dá)30～45 t/hm2；營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好，作為青飼料可為各種家畜提供高蛋白，也可曬制成干草[8]，是優(yōu)良綠肥和覆蓋植物、飼料[9]，生長(zhǎng)管理粗放能在貧瘠的磚壤土中生長(zhǎng)；并且它極其耐旱、耐蔭，適口性好，可固氮，能抵御葉斑病和紅蜘蛛侵害，抵制雜草入侵，具有極大的種植潛力[10-15]。目前已在草地早熟禾[16]、狗牙根[17]、豇豆[18]等多種草本、豆科植物的不同生育期開(kāi)展了耐鹽性鑒定與篩選。國(guó)內(nèi)外對(duì)蝴蝶豆的研究主要包括其苗期耐鹽[19]、抗旱[20]、高溫脅迫[21]等一些抗逆性研究，但都未形成可靠有效的評(píng)價(jià)體系。嚴(yán)琳玲等[19]對(duì)20 份蝴蝶豆種質(zhì)材料苗期進(jìn)行不同鹽濃度脅迫，將其分為2 類(lèi)：耐鹽型種質(zhì)和不耐鹽種質(zhì)。相對(duì)于蝴蝶豆而言耐鹽性研究略有欠缺，且作為優(yōu)質(zhì)牧草、綠肥能夠更加廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)、生活中。故此，評(píng)估現(xiàn)有75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)資源的耐鹽性強(qiáng)弱，挑選出耐鹽種質(zhì)，大面積種植之后，不僅提高生產(chǎn)量也實(shí)現(xiàn)了高效利用鹽堿地的目標(biāo)。

本研究以75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)為材料，鹽脅迫針對(duì)芽期做處理，記錄相關(guān)的形態(tài)，并利用隸屬函數(shù)、主成分分析、聚類(lèi)分析等評(píng)價(jià)方法對(duì)蝴蝶豆屬種質(zhì)萌芽期耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出鑒定蝴蝶豆耐鹽性的最適濃度和篩選耐鹽性的指標(biāo)，并對(duì)不同評(píng)價(jià)方法所得結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，最終挑選出耐鹽性較強(qiáng)的材料。為開(kāi)發(fā)耐鹽優(yōu)異的蝴蝶豆資源和培育耐鹽性強(qiáng)的新品種提供材料和理論支持，為前人研究進(jìn)行補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用75 份蝴蝶豆種質(zhì)由國(guó)家熱帶牧草種質(zhì)資源中期（備份）庫(kù)提供。包括CIAT 國(guó)外引進(jìn)的資源和國(guó)內(nèi)野外收集的資源，共1 屬3 種75 份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫濃度確定 從所有距瓣豆屬種質(zhì)資源材料中隨機(jī)選取7 份，挑選均勻、飽滿(mǎn)、健康的種子。采用培養(yǎng)濾紙法。鹽（NaCl）濃度為：0、50、100、150、200、250 mmol/L，以50 mmol/L為梯度設(shè)置。每濃度處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)種子30 粒。種子用75%酒精浸泡15 min，再用10%的過(guò)氧化氫浸泡30 s 殺菌、消毒，再用清水清洗，打破種子休眠，待用。將種子均勻地置于90 mm的培養(yǎng)皿中，每處理添加10 mL 對(duì)應(yīng)的鹽溶液，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)（25 ℃，16 h 光照，8 h 黑暗，光強(qiáng)4000 lx）。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，第6 天發(fā)芽停止，結(jié)束試驗(yàn)，測(cè)量其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)等。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)：胚根長(zhǎng)≥種子長(zhǎng)度的1/2。

1.2.2 芽期耐鹽種質(zhì)篩選 確定適宜篩選濃度150 mmol/L，處理組加入10 mL 該濃度鹽溶液，對(duì)照組加入等量的蒸餾水，每種質(zhì)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 粒。種子處理方法同1.2.1，并測(cè)量相關(guān)指標(biāo)：

發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=6 d 發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=Σ 每天發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)

根冠比=根長(zhǎng)/芽長(zhǎng)

相對(duì)值=鹽處理測(cè)定值/對(duì)照處理測(cè)定值

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和IBM SPSS 軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)算每項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和平均隸屬函數(shù)值，參考張會(huì)麗等[22]的方法；計(jì)算權(quán)重（W_j）和綜合得分值（Z_j），參考劉丙花等[23]和李艷輝等[24]的方法，如以下公式所示。利用系統(tǒng)聚類(lèi)法，將所有種質(zhì)分類(lèi)，得到種質(zhì)資源聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選耐鹽種質(zhì)的適宜鹽濃度

為了確定蝴蝶豆萌芽期耐鹽的適宜篩選濃度，隨機(jī)挑選7 份蝴蝶豆種質(zhì)在不同鹽濃度下進(jìn)行處理。由表2、表3，圖1 可知，當(dāng)鹽濃度為0～100 mmol/L 時(shí)，各組材料間的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率大多在50%以上，相比差異均不顯著；鹽濃度為200～250 mmol/L 時(shí)，多組材料的發(fā)芽勢(shì)均低于40%，發(fā)芽率均低于30%，且個(gè)別組的材料表現(xiàn)未發(fā)芽，由此可見(jiàn)鹽濃度越高對(duì)種子萌發(fā)影響力越大甚至導(dǎo)致其死亡；但鹽濃度在150 mmol/L時(shí)，各組材料的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均值為50%的約占1/2，這說(shuō)明各種質(zhì)在此濃度下表現(xiàn)差異顯著，可有效區(qū)分各種質(zhì)的耐鹽差異性。因此，本研究借助發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的顯著差異性確定了蝴蝶豆耐鹽種質(zhì)的適宜篩選濃度為150 mmol/L 的鹽溶液。

2.2 鹽脅迫下蝴蝶豆種子萌發(fā)的影響

在150 mmol/L 鹽脅迫下，75 份蝴蝶豆種質(zhì)發(fā)芽指標(biāo)中相對(duì)根冠比變異系數(shù)最大，為67.75%（表4）。這表明所測(cè)蝴蝶豆耐鹽性相對(duì)根冠比變異比較豐富，存在較大差異，可以作為蝴蝶豆耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)。各種質(zhì)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)集中在50%左右，根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)小于15 mm 的種質(zhì)分別占30%和50%（圖2），說(shuō)明鹽脅迫對(duì)蝴蝶豆的發(fā)芽指標(biāo)相對(duì)于根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)來(lái)說(shuō)影響較小，鹽脅迫嚴(yán)重抑制了蝴蝶豆根和芽的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.3 鹽脅迫下各指標(biāo)的相關(guān)性分析

鹽脅迫下，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（表5）表明，蝴蝶豆與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)相關(guān)的任意2 個(gè)發(fā)芽指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），其中發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)的相關(guān)系數(shù)最大，為0.992，發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)相關(guān)系數(shù)最小，為0.344。而芽長(zhǎng)和根冠比以及相對(duì)值之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），且相關(guān)系數(shù)表示芽長(zhǎng)與根冠比之間關(guān)系密切，系數(shù)最大，為?0.609，說(shuō)明芽長(zhǎng)越長(zhǎng)根冠比、相對(duì)根冠比就越小，反之則越大。鹽脅迫下蝴蝶豆萌芽期各指標(biāo)間均存在著不同程度的相關(guān)性，因此可選擇主要指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)蝴蝶豆種質(zhì)的耐鹽性。

2.4 主成分分析

在對(duì)蝴蝶豆所有發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，再進(jìn)行主成分分析，并根據(jù)每個(gè)成分的特征值和貢獻(xiàn)率提取主成分（表6）。其中有4 個(gè)特征值大于1 的成分，因此將這4 個(gè)成分作為主成分，其特征值分別為5.20、2.99、2.06、1.39，方差貢獻(xiàn)率為37.12%、21.37%、14.72%和9.95%。這4 個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)83.17%，超過(guò)了80%，說(shuō)明因子的提取效果很好，涵蓋了所有指標(biāo)的大部分信息，整體歸納性好、綜合反應(yīng)性強(qiáng)，可將其作為蝴蝶豆耐鹽種質(zhì)評(píng)價(jià)篩選的綜合指標(biāo)。

由各主成分載荷矩陣（表7）可知，唯一對(duì)第一主成分產(chǎn)生負(fù)向影響的是根冠比且影響不大，其數(shù)值為?0.026，其余指標(biāo)均對(duì)第一主成分產(chǎn)生正向影響。其中，影響最大的是發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)，數(shù)值分別為0.872、0.865、0.855、0.789，說(shuō)明發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)及相對(duì)發(fā)芽勢(shì)對(duì)第一主成分起主要正向影響作用。

對(duì)第二主成分產(chǎn)生正向影響的指標(biāo)有發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、鮮重、相對(duì)芽長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、相對(duì)鮮重、根冠比，其余指標(biāo)對(duì)第二主成分產(chǎn)生負(fù)向影響。其中，相對(duì)芽長(zhǎng)、芽長(zhǎng)起主要正向影響較大，數(shù)值分別為0.786、0.709；根長(zhǎng)、相對(duì)根冠比、相對(duì)根長(zhǎng)起主要負(fù)向影響，數(shù)值分別為?0.464、?0.835、?0.552；發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)對(duì)第二主成分影響不大。

第三主成分負(fù)向指標(biāo)：相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽率、芽長(zhǎng)，其載荷值分別為?0.528、?0.613、?0.639、?0.018，其余均為第三主成分正向指標(biāo)。其中，根長(zhǎng)、相對(duì)根冠比、相對(duì)根長(zhǎng)、根冠比對(duì)第三主成分起主要正向影響，數(shù)值為0.479、0.342、0.521、0.339；而相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽率起主要負(fù)向影響；芽長(zhǎng)對(duì)第三主成分影響可忽略不計(jì)。

第四主成分影響因素中鮮重、相對(duì)鮮重可忽略不計(jì)，負(fù)向影響因素有發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、芽長(zhǎng)，其余均為正向指標(biāo)。其中，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)芽長(zhǎng)、根冠比對(duì)第三主成分起主要正向影響，數(shù)值為0.300、0.333、0.444、0.662；而發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)起主要負(fù)向影響。

2.5 蝴蝶豆耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

對(duì)75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，將綜合得分值和平均隸屬函數(shù)值（ASF）作為評(píng)價(jià)耐鹽性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，綜合得分值和ASF 值越大，表明其耐鹽性就越強(qiáng)，反之則越弱。首先將蝴蝶豆發(fā)芽指標(biāo)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，借助公式（5）計(jì)算綜合得分（Z=0.37Z1+0.21Z2+0.14Z3+0.09Z4）進(jìn)行排序（表8）。綜合得分值為?0.745～2.003，跨度范圍大也表明各種質(zhì)間耐鹽性差異較大。排名前十的耐鹽種質(zhì)為：69＞2＞4＞12＞49＞1＞21＞6＞20＞18，排名后十的敏鹽種質(zhì)為：57＜55＜63＜45＜52＜54＜65＜30＜70＜73。這2 種評(píng)價(jià)方法都表達(dá)了蝴蝶豆的耐鹽差異性較大。

然后對(duì)平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行排序（表8），平均隸屬函數(shù)值（不超過(guò)1）范圍在0.14～0.61 之間，其值跨度范圍大表明各種質(zhì)間耐鹽性差異較大。綜合排名前十的種質(zhì)為：59>67>12>20>2>4>1>69>75>49，綜合排名后十的種質(zhì)為：45＜63＜65＜30＜48＜31＜15＜57＜51＜55。用這2 種綜合評(píng)價(jià)方法來(lái)評(píng)價(jià)蝴蝶豆的耐鹽性，表明不同評(píng)價(jià)方法對(duì)75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽強(qiáng)弱的排名稍有不同，但大體差異不大，耐鹽材料和敏鹽材料的篩選結(jié)果基本一致。

2.6 聚類(lèi)分析

綜合得分值（Z）其包括信息全面，因此對(duì)蝴蝶豆耐鹽綜合得分值進(jìn)行最遠(yuǎn)距離系統(tǒng)聚類(lèi)分析，在歐式距離為4 處可將75 份蝴蝶豆種質(zhì)分為四大類(lèi)（圖3）。第1 類(lèi)為極耐鹽種質(zhì)，編號(hào)69單獨(dú)分為一類(lèi)；第2 類(lèi)為耐鹽種質(zhì)，包括編號(hào)2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份；第3 類(lèi)為低耐鹽種質(zhì)，編號(hào)52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質(zhì)；第4 類(lèi)編號(hào)29、10、59 等50 份材料為敏鹽種質(zhì)。

3 討論

我國(guó)土壤鹽漬化形勢(shì)日益嚴(yán)峻，目前，最為經(jīng)濟(jì)、有效利用鹽漬土的途徑是種植耐鹽植物對(duì)土壤進(jìn)行生物改良[25]。蝴蝶豆在國(guó)內(nèi)外作為優(yōu)質(zhì)飼料[26]和綠肥覆蓋物[10-11]，其種質(zhì)資源數(shù)量龐大、質(zhì)量?jī)?yōu)異，遺傳變異種類(lèi)豐富多樣，為開(kāi)展蝴蝶豆種質(zhì)資源的研究和創(chuàng)新提供重要材料基礎(chǔ)。因此，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)和利用耐鹽性強(qiáng)的蝴蝶豆種質(zhì)資源，對(duì)蝴蝶豆品種的選育具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究首先對(duì)7 份蝴蝶豆種質(zhì)萌芽期在6個(gè)不同鹽濃度下的研究發(fā)現(xiàn)，150 mmol/L 鹽溶液脅迫下，蝴蝶豆表現(xiàn)出較大的耐鹽性差異，因此確定該濃度為最適宜篩選濃度，與張紅梅等[18]在豇豆耐鹽性研究方面的結(jié)果一致。然后在150 mmol/L 濃度下，綜合評(píng)價(jià)75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)材料的耐鹽性，研究表明，鹽處理材料與對(duì)照相比，各種質(zhì)的開(kāi)始發(fā)芽時(shí)間普遍延遲了約1 d，該現(xiàn)象與田蕾等[27]對(duì)粳稻進(jìn)行鹽脅迫過(guò)程的表現(xiàn)一致，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)植物芽期影響嚴(yán)重。

變異系數(shù)變化值較大的性狀指標(biāo)更能反映出材料間的耐鹽性差異[28]。研究中，蝴蝶豆種質(zhì)發(fā)芽指標(biāo)中相對(duì)根冠比變異系數(shù)最大（67.75%），表明所測(cè)蝴蝶豆耐鹽性相對(duì)根冠比變異比較豐富，存在較大差異，因此可作為蝴蝶豆耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過(guò)相關(guān)性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根冠比、相對(duì)發(fā)芽率和根冠比這4 個(gè)指標(biāo)與主成分關(guān)系最為密切，完全囊括了變異分析的信息，且包括蝴蝶豆耐鹽特性的大部分信息，因此將這4 個(gè)指標(biāo)作為耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)。田蕾等[27]發(fā)現(xiàn)水稻芽期評(píng)價(jià)指標(biāo)為發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)鹽害率；孫璐等[29]確定根長(zhǎng)、鮮重和發(fā)芽率作為鑒定高粱耐鹽性指標(biāo)。由此可以看出，發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)、發(fā)芽率差異變化較大，可作為耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶豆種質(zhì)的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均在25 mm 以下，且15 mm 左右的占比最大，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)普遍在50%左右，由此可知，相對(duì)于種質(zhì)發(fā)芽，胚根和胚芽的生長(zhǎng)對(duì)NaCl 脅迫更為敏感，這與羅小燕等[30]對(duì)山螞蝗的研究、楊林[31]對(duì)豆科牧草的研究結(jié)果一致，根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)受鹽脅迫影響最大。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，蝴蝶豆在鹽脅迫下，萌芽期各類(lèi)指標(biāo)間有不同程度的關(guān)聯(lián)性，這與前人研究結(jié)果一致[32]，發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)相關(guān)任意2個(gè)指標(biāo)間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01），胚芽長(zhǎng)和相對(duì)根冠比、根冠比相互之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。本研究使用的各類(lèi)指標(biāo)對(duì)蝴蝶豆耐鹽性綜合評(píng)價(jià)貢獻(xiàn)率不同，因此，要精確得出蝴蝶豆的耐鹽性，應(yīng)有更多的指標(biāo)進(jìn)行研究，再進(jìn)行綜合分析，這樣才能全面反映蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性強(qiáng)弱。

本研究對(duì)綜合得分進(jìn)行聚類(lèi)分析，將75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)分為四大類(lèi)，編號(hào)69 為第1 類(lèi)極耐鹽種質(zhì)；第2 類(lèi)為耐鹽種質(zhì)（編號(hào)2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份）；第3 類(lèi)為低耐鹽種質(zhì)（編號(hào)52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質(zhì)）；第4 類(lèi)為敏鹽種質(zhì)（編號(hào)29、10、59 等50 份）。編號(hào)69 的蝴蝶豆種質(zhì)通過(guò)平均隸屬函數(shù)分析，得出其數(shù)值0.542，排名第8，綜合分析得分2.003，排名第1，2 種評(píng)價(jià)體系下綜合表現(xiàn)優(yōu)異，最耐鹽。但由于不同生長(zhǎng)階段，植物的耐鹽性有一定的差異，所以萌芽期篩選出的耐鹽種質(zhì)能在苗期有何種表現(xiàn)需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)不同鹽濃度梯度篩選出最適濃度為150 mmol/L，在該濃度處理下測(cè)定75 份蝴蝶豆種質(zhì)萌芽期相關(guān)耐鹽指標(biāo)，通過(guò)相關(guān)性分析、主成分分析、聚類(lèi)分析對(duì)75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定蝴蝶豆耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)是發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根冠比、相對(duì)發(fā)芽率和根冠比，結(jié)果表明，050321057 蝴蝶豆（編號(hào)69）在參試種質(zhì)材料中表現(xiàn)出極其耐鹽性。為蝴蝶豆耐鹽性研究和選育耐鹽品種提供理論支撐。