雷艷?詹世淮?施曉華?楊蘭?王佳偉　王水良?張勝行

【摘要】目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體（hUC-MSC-Exo）對衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞（HKC）凋亡的作用。方法 利用衣霉素誘導(dǎo)HKC產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CCK-8法檢測細胞增殖活性；蛋白免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、GRP94和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；hUC-MSC-Exo經(jīng)分離與流式細胞術(shù)表面標志物鑒定后，檢測不同濃度外泌體（0、40、60、80、100、150、200 μg/mL）對細胞活性的影響；resazurin法與流式細胞術(shù)分別檢測外泌體與衣霉素共處理組的細胞增殖活性及細胞凋亡水平。結(jié)果 1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制HKC的細胞增殖活性并呈濃度依賴性；不同濃度衣霉素均可誘導(dǎo)HKC細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并明顯誘導(dǎo)細胞凋亡。100、150、200 μg/mL外泌體能增強細胞增殖活性；與衣霉素2 μg/mL組相比，衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細胞增殖活性明顯增強；此外，衣霉素2 μg/mL組細胞凋亡率為（14.16±1.58）%，衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細胞凋亡率為（8.18±0.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 間充質(zhì)干細胞源外泌體能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的HKC細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；間充質(zhì)干細胞源外泌體；細胞凋亡；衣霉素；腎小管上皮細胞

Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes protect renal tubular epithelial cells against tunicamycin-induced apoptosis Lei Yan△， Zhan Shihuai， Shi Xiaohua， Yang Lan， Wang Jiawei， Wang Shuiliang， Zhang Shenghang. △Fujian Key Laboratory of Aptamers Technology， the 900th Hospital of Joint Logistics Support Force， Fuzhou 350025， China

Corresponding author， Zhang Shenghang， E-mail： fzzyyzsh@126.com

【Abstract】Objective To investigate the role of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes （hUC-MSC-Exo） in the tunicamycin-induced apoptosis of renal tubular epithelial cells （HKC）. Methods Endoplasmic reticulum stress （ERS） was induced by tunicamycin in HKC cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The expression levels of ERS-related proteins of glucose-regulated protein 78 （GRP78）， GRP94 and C/EBP homologous protein （CHOP） were determined by Western blot. Cell apoptosis was assessed by flow cytometry. hUC-MSC-Exo were isolated and identified by flow cytometry. The effects of different concentrations of hUC-MSC-Exo （0， 40， 60， 80， 100， 150 and 200 μg/mL） upon cell activity were evaluated. Cell proliferation and apoptosis after co-treatment with hUC-MSC-Exo and tunicamycin were assessed by resazurin assay and flow cytometry. Results Treatment with 1， 2 and 4 μg/mL tunicamycin could inhibit the proliferation of HKC in a concentration-dependent manner. Different concentrations of tunicamycin could induce ERS and cell apoptosis in HKC. Treatment with 100， 150 and 200 μg/mL hUC-MSC-Exo could enhance cell proliferation. Compared with the 2 μg/mL tunicamycin group， cell proliferation was significantly increased in the?2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group （P < 0.05）. The apoptosis rate in the 2 μg/mL tunicamycin group was （14.16±1.58）%， and （8.18±0.58）% in the 2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion hUC-MSC-Exo can significantly alleviate HKC apoptosis induced by ERS.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress； Mesenchymal stem cell-derived exosome； Apoptosis； Tunicamycin；

Renal tubular epithelial cell

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是細胞應(yīng)激的一種重要方式，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白蓄積過多會導(dǎo)致ERS發(fā)生［1］。ERS參與了缺氧、腎缺血再灌注損傷（IRI）、腎毒性和炎癥等引起的急性腎損傷（AKI）發(fā)病機制，這些病理狀態(tài)均能誘導(dǎo)腎小管上皮細胞產(chǎn)生ERS，并誘導(dǎo)細胞凋亡［2-3］。衣霉素作為ERS的常用誘導(dǎo)劑，通過抑制N-糖基化并阻斷N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶，引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累而誘導(dǎo)ERS［4-5］。人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體（hUC-MSC-Exo）攜帶著蛋白分子、mRNA、微RNA及長鏈非編碼RNA等作為細胞與細胞通信之間的聯(lián)系［6］。研究表明，hUC-MSC-Exo通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路的激活而抑制腎小管上皮細胞的凋亡［7］。MSC-Exo通過上調(diào)miR-146b的水平從而抑制NF-κB活性和減輕炎癥反應(yīng)，降低膿毒癥相關(guān)的AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平，抑制了腎小管細胞凋亡［8］。盡管MSC-Exo顯示出腎臟保護作用，但MSC-Exo對ERS狀態(tài)下腎小管上皮細胞的作用機制尚未闡明。本研究旨在研究ERS狀態(tài)下MSC-Exo對腎小管上皮細胞凋亡的調(diào)控，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、材 料

1. 試 劑

衣霉素購自瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM購自美國Hyclone公司。胎牛血清、 抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、GRP94、C/EBP同源蛋白（CHOP）、裂解的核糖聚合酶（c-PARP）、CD9、CD81、脂筏結(jié)構(gòu)蛋白1（Flotin1）、 β-肌動蛋白（β-actin）、兔抗IgG、鼠抗IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。流式抗體CD63、CD9、CD81購自Biolenged公司。二辛可寧酸（BCA） 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司。基于Luminol 的增強化學(xué)發(fā)光（ECL）底物試劑蛋白顯色液購自德國Advansta公司。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒購自美國Biolenged公司。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒購自美國MedChem公司。Adamas life刃天青（resazurin）細胞活性檢測染料購自上海泰坦科技股份有限公司。ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司。

2. 細 胞

人腎小管上皮細胞（HKC）細胞由中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供；hUC-MSC由福建省干細胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供，取P3代細胞進行研究。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)

hUC-MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的低糖培養(yǎng)基中；腎小管上皮細胞HKC培養(yǎng)于10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基中，細胞均置于含體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中。

2. 臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體的分離

按文獻［9］方法操作：取P3代的hUC-MSC，無血清純DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集上清，經(jīng)3 000×g 15 min離心去除細胞碎片，按照ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒的說明書，將10 mL上清液與2 mL ExoQuick-TC試劑輕輕混合，于4℃過夜（至少12 h），在孵育期間離心管保持直立且不能搖動。經(jīng)1 500×g離心30 min吸棄上清液，1 500×g離心5 min后，輕輕吸棄所有的液體，避免干擾到底部的外泌體沉淀。最后經(jīng)100～500 μL無菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸即可得到外泌體溶液。

3. 不同濃度衣霉素對細胞存活的影響

采用CCK-8法：HKC正常傳代培養(yǎng)，胰酶消化后鏡下計數(shù)細胞，5 000個/孔接種于96孔板，次日用含0.5%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基將衣霉素稀釋成不同的濃度（0、1、2、4 μg/mL），每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h，將96孔板置于酶標儀上，測定450 nm處吸光度值，以對照組為100%，則細胞存活率=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

4. 不同濃度外泌體對細胞增殖的影響

每孔5 000個HKC接種于96孔板中，次日加入不同濃度［0（Con）、40、60、80、100、150、200 μg/mL］外泌體或2 μg/mL衣霉素作用24 h后，按照上述CCK-8法測定450 nm吸光度。

5. resazurin法檢測細胞增殖活性

每孔5 000個HKC接種于24孔板中，次日實驗分組為對照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組，作用24 h后，每孔加入30 μL的resazurin溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，在590 nm處測定熒光強度。

6. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

各組收集的總蛋白用BCA法檢測總蛋白濃度，隨后取30 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。室溫下4%牛血清白蛋白BSA搖床上封閉1 h后，與1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20（TBST）洗膜3次，加入不同比例稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST、PBS各洗膜3次后，加入ECL發(fā)光液孵育3 min后進行曝光顯影。各蛋白表達量均以 β-actin為內(nèi)參。

7. 流式熒光激活細胞分選術(shù)檢測細胞凋亡

HKC經(jīng)不同濃度衣霉素或與外泌體聯(lián)合處理24 h，胰酶消化后收集細胞沉淀，經(jīng)預(yù)冷的細胞染色液洗滌2次，加入試劑盒中的結(jié)合液重懸至細胞濃度為1×107/mL。每管吸取100 μL的細胞懸液，加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI）混勻后避光染色15 min。每管加入400 μL 結(jié)合液重懸后即上機檢測。同時設(shè)置正常組細胞不染色調(diào)電壓，經(jīng)FITC Annexin Ⅴ和PI分別單染的細胞調(diào)補償。

8. 流式細胞術(shù)檢測外泌體表面標志物

將提取的40 μL外泌體與5 μL硫酸鹽微珠室溫共孵育15 min，加入5 μL 100 μmol/L的BSA溶液，室溫孵育15 min。加入1 mL PBS孵育75 min，580×g離心5 min，棄上清液。將外泌體微珠（beads）的結(jié)合體中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室溫孵育30 min，經(jīng)離心PBS洗滌2次后，重懸在350 μL PBS中，每管50 μL分裝于流式管中，加入CD9、CD63、CD81的一抗（1∶200）避光孵育45 min，離心重懸后立即上機檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析結(jié)果，CCK-8法檢測細胞增殖活性，每個濃度5個復(fù)孔，取各濃度的平均值進行分析；熒光強度檢測重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔；流式細胞術(shù)分析3次重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)，取各次實驗的均值為最后結(jié)果。連續(xù)變量以表示，多組間比較使用單因素方差分析，多重比較使用Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、衣霉素誘導(dǎo)HKC細胞產(chǎn)生ERS并誘導(dǎo)凋亡

不同濃度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的細胞存活率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F = 26.650，P = 0.001），隨后使用Dunnett-t檢驗顯示，1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制細胞增殖（P均< 0.05），且細胞存活率隨著衣霉素濃度增加呈下降趨勢（圖1A）。1、2、4 μg/mL衣霉素均能誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白GRP78、GRP94和CHOP表達上調(diào)（圖1B），2、4 μg/mL衣霉素誘導(dǎo)下的細胞凋亡早期標志物c-PARP蛋白表達增強（圖1C）；流式細胞術(shù)顯示，不同濃度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的細胞凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 59.960，P < 0.001），且1、2、4 μg/mL衣霉素作用下HKC凋亡加重（P均< 0.05），其中1、2、4 μg/mL衣霉素作用于HKC 24 h的細胞凋亡率分別為（6.32±0.23）%、（11.29±2.89）% 和（18.03±0.21）%（圖1D）。

二、hUC-MSC外泌體的鑒定

蛋白免疫印跡分析顯示，常氧及缺氧培養(yǎng)條件下hUC-MSC外泌體均共表達CD9、CD81和Flotin1這些外泌體的代表性標志物。流式細胞術(shù)檢測進一步證實來源于hUC-MSC外泌體中CD9（59.2%）、CD63（73.4%）和CD81（63.5%）均呈陽性表達。見圖2。

三、hUC-MSC-Exo對HKC細胞增殖和凋亡的影響

不同組別作用HKC 24 h的細胞增殖活性總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F = 449.200，P < 0.001），隨后使用Dunnett-t檢驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，加入40、60、80 μg/mL外泌體未明顯促進HKC的細胞增殖活性，而加入100 μg/mL 外泌體處理的HKC細胞增殖活性為113.41%（P = 0.006）；經(jīng)150 μg/mL和200 μg/mL 外泌體處理HKC細胞增殖活性分別為122.51%（P = 0.004）和141.68%（P = 0.001），見圖3A。resazurin法檢測細胞活性結(jié)果表明，衣霉素2 μg/mL組的熒光強度低于對照組（P = 0.002），而衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的熒光強度高于衣霉素組（P =0.012），見圖3B、C。對照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的細胞凋亡率分別為（0.18±0.01）%、（14.16±1.58）%、（8.18%±0.58）%，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 152.000，P < 0.001），對照組與衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL組與衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），見圖3D。

討論

腎臟缺氧/缺血、重金屬毒性、抗癌免疫抑制藥及急慢性炎癥反應(yīng)等多種因素均是AKI的誘因，最終都會導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷，嚴重的損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡［10-11］。ERS和AKI之間的關(guān)系已被體外和體內(nèi)實驗所證實，AKI患者的腎活檢中，ERS標志分子物表達與AKI的嚴重程度密切相關(guān)［12］。腎臟缺血再灌注后近端小管細胞Grp78蛋白表達快速增加，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）啟動，在缺血損傷初期發(fā)揮保護作用，在嚴重ERS的狀態(tài)下通過CHOP促進caspase的級聯(lián)反應(yīng)凋亡信號通路，促進細胞凋亡［1］。

MSC-Exo在治療AKI中起重要作用，然而，MSC-Exo對ERS誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的分子機制研究還很局限，因此研究MSC-Exo對ERS誘導(dǎo)的腎損傷的分子機制具有重要的現(xiàn)實意義。本研究中不同濃度的衣霉素（1、2、4 μg/mL）均能誘導(dǎo)HKC細胞產(chǎn)生ERS，相關(guān)的分子GRP78、GRP94和CHOP表達上調(diào)，并呈濃度依賴性；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也表明ERS狀態(tài)下能誘導(dǎo)HKC細胞凋亡。hUC-MSC-Exo處理組能明顯增強細胞增殖活性；衣霉素誘導(dǎo)組細胞凋亡率為（14.16±1.58）%，而外泌體與衣霉素共處理組細胞凋亡率為（8.18±0.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。筆者所在課題組的前期研究表明，hUC-MSC-Exo能通過攜帶的miR-21抑制ERS和p38 MAPK的磷酸化，從而減緩ERS并明顯降低了胰島內(nèi)皮細胞的凋亡率［13］。本研究結(jié)果進一步表明，hUC-MSC-Exo能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，從而在AKI中發(fā)揮保護作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo可通過激活A(yù)KT和ERK信號通路，減輕髓核細胞ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡［14］。Buono等［15］以衣霉素誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細胞ERS為模型，MSC釋放的細胞外囊泡（EV）能夠誘導(dǎo)人角膜內(nèi)皮細胞中ERS相關(guān)基因ATF4、GRP78、XBP1、CHOP顯著下調(diào)，并抑制caspase-3蛋白的表達，其機制是通過MSC-EV中與ERS靶向性的微RNA分子，如miR-222-3p、miR-125b-5p、miR-21-5p轉(zhuǎn)移至角膜內(nèi)皮細胞而發(fā)揮潛在的治療作用。Xie等［16］的研究表明MSC-Exo中miR-31-5p負調(diào)節(jié)ERS分子ATF6，通過miR-31-5p/ATF6/ER應(yīng)激通路調(diào)節(jié)抑制椎體終板軟骨細胞凋亡和鈣化，這表明MSC-Exo在不同的ERS模型中均發(fā)揮一定的抗凋亡作用。本研究中，在ERS狀態(tài)下，MSC-Exo可以減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，但外泌體發(fā)揮作用的信號通路及外泌體中的何種成分參與了ERS的調(diào)控將是我們下一步研究中要關(guān)注的重點。

綜上所述，本研究表明hUC-MSC-Exo能明顯抑制ERS狀態(tài)下腎小管上皮細胞凋亡。

參 考 文 獻

［1］ Shu S， Zhu J， Liu Z， et al. Endoplasmic reticulum stress is activated in post-ischemic kidneys to promote chronic kidney disease. EBioMedicine， 2018， 37： 269-280.

［2］ Sicari D， Delaunay-Moisan A， Combettes L， et al. A guide to assessing endoplasmic reticulum homeostasis and stress in mammalian systems. FEBS J， 2020， 287（1）： 27-42.

［3］ Maekawa H， Inagi R. Pathophysiological role of organelle stress/crosstalk in AKI-to-CKD transition. Semin Nephrol， 2019， 39（6）： 581-588.

［4］ Jackisch L， Murphy A M， Kumar S， et al. Tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress mediates mitochondrial dysfunction in human adipocytes. J Clin Endocrinol Metab， 2020， 105（9）： dgaa258.

［5］ Carlisle R E， Farooqi S， Zhang M C， et al. Inhibition of histone deacetylation with vorinostat does not prevent tunicamycin-mediated acute kidney injury. PLoS One， 2021， 16（11）： e0260519.

［6］ Phinney D G， Pittenger M F. Concise review： MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells， 2017， 35（4）： 851-858.

［7］ Liu B， Hu D， Zhou Y， et al. Erratum： Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against renal interstitial fibrosis through ROS-mediated P38MAPK/ERK signaling pathway. Am J Transl Res， 2021， 13（4）： 3921-3922.

［8］ Zhang R， Zhu Y， Li Y， et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes alleviate sepsis-associated acute kidney injury via regulating microRNA-146b expression. Biotechnol Lett， 2020， 42（4）： 669-679.

［9］ Shahir M， Mahmoud Hashemi S， Asadirad A， et al. Effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on the induction of mouse tolerogenic dendritic cells. J Cell Physiol， 2020， 235（10）： 7043-7055.

［10］ Yan M， Shu S， Guo C， et al. Endoplasmic reticulum stress in ischemic and nephrotoxic acute kidney injury. Ann Med， 2018， 50（5）： 381-390.

［11］ 梁日英， 符暢， 梁華， 等. 利拉魯肽抑制ERS改善高脂飲食誘導(dǎo)的DN腎損害. 新醫(yī)學(xué)， 2019， 50（11）： 826-831.

［12］ Rojas-Franco P， Franco-Colín M， Torres-Manzo A P， et al. Endoplasmic reticulum stress participates in the pathophysiology of mercury-caused acute kidney injury. Ren Fail， 2019， 41（1）： 1001-1010.

［13］ Chen J， Chen J， Cheng Y， et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes protect beta cells against hypoxia-induced apoptosis via miR-21 by alleviating ER stress and inhibiting p38 MAPK phosphorylation. Stem Cell Res Ther， 2020， 11（1）： 97.

［14］ Liao Z， Luo R， Li G， et al. Exosomes from mesenchymal stem cells modulate endoplasmic reticulum stress to protect against nucleus pulposus cell death and ameliorate intervertebral disc degeneration in vivo. Theranostics， 2019， 9（14）： 4084-4100.

［15］ Buono L， Scalabrin S， De Iuliis M， et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles protect human corneal endothelial cells from endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis. Int J Mol Sci， 2021， 22（9）： 4930.

［16］ Xie L， Chen Z， Liu M， et al. MSC-derived exosomes protect vertebral endplate chondrocytes against apoptosis and calcification via the miR-31-5p/ATF6 axis. Mol Ther Nucleic Acids， 2020， 22： 601-614.

（收稿日期：2022-09-30）

（本文編輯：林燕薇）