雷艷?詹世淮?施曉華?楊蘭?王佳偉 王水良?張勝行
【摘要】目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體(hUC-MSC-Exo)對衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞(HKC)凋亡的作用。方法 利用衣霉素誘導(dǎo)HKC產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,CCK-8法檢測細胞增殖活性;蛋白免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、GRP94和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;hUC-MSC-Exo經(jīng)分離與流式細胞術(shù)表面標志物鑒定后,檢測不同濃度外泌體(0、40、60、80、100、150、200 μg/mL)對細胞活性的影響;resazurin法與流式細胞術(shù)分別檢測外泌體與衣霉素共處理組的細胞增殖活性及細胞凋亡水平。結(jié)果 1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制HKC的細胞增殖活性并呈濃度依賴性;不同濃度衣霉素均可誘導(dǎo)HKC細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并明顯誘導(dǎo)細胞凋亡。100、150、200 μg/mL外泌體能增強細胞增殖活性;與衣霉素2 μg/mL組相比,衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細胞增殖活性明顯增強;此外,衣霉素2 μg/mL組細胞凋亡率為(14.16±1.58)%,衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細胞凋亡率為(8.18±0.58)%,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 間充質(zhì)干細胞源外泌體能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的HKC細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;間充質(zhì)干細胞源外泌體;細胞凋亡;衣霉素;腎小管上皮細胞
Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes protect renal tubular epithelial cells against tunicamycin-induced apoptosis Lei Yan△, Zhan Shihuai, Shi Xiaohua, Yang Lan, Wang Jiawei, Wang Shuiliang, Zhang Shenghang. △Fujian Key Laboratory of Aptamers Technology, the 900th Hospital of Joint Logistics Support Force, Fuzhou 350025, China
Corresponding author, Zhang Shenghang, E-mail: fzzyyzsh@126.com
【Abstract】Objective To investigate the role of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes (hUC-MSC-Exo) in the tunicamycin-induced apoptosis of renal tubular epithelial cells (HKC). Methods Endoplasmic reticulum stress (ERS) was induced by tunicamycin in HKC cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The expression levels of ERS-related proteins of glucose-regulated protein 78 (GRP78), GRP94 and C/EBP homologous protein (CHOP) were determined by Western blot. Cell apoptosis was assessed by flow cytometry. hUC-MSC-Exo were isolated and identified by flow cytometry. The effects of different concentrations of hUC-MSC-Exo (0, 40, 60, 80, 100, 150 and 200 μg/mL) upon cell activity were evaluated. Cell proliferation and apoptosis after co-treatment with hUC-MSC-Exo and tunicamycin were assessed by resazurin assay and flow cytometry. Results Treatment with 1, 2 and 4 μg/mL tunicamycin could inhibit the proliferation of HKC in a concentration-dependent manner. Different concentrations of tunicamycin could induce ERS and cell apoptosis in HKC. Treatment with 100, 150 and 200 μg/mL hUC-MSC-Exo could enhance cell proliferation. Compared with the 2 μg/mL tunicamycin group, cell proliferation was significantly increased in the?2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group (P < 0.05). The apoptosis rate in the 2 μg/mL tunicamycin group was (14.16±1.58)%, and (8.18±0.58)% in the 2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion hUC-MSC-Exo can significantly alleviate HKC apoptosis induced by ERS.
【Key words】Endoplasmic reticulum stress; Mesenchymal stem cell-derived exosome; Apoptosis; Tunicamycin;
Renal tubular epithelial cell
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是細胞應(yīng)激的一種重要方式,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白蓄積過多會導(dǎo)致ERS發(fā)生[1]。ERS參與了缺氧、腎缺血再灌注損傷(IRI)、腎毒性和炎癥等引起的急性腎損傷(AKI)發(fā)病機制,這些病理狀態(tài)均能誘導(dǎo)腎小管上皮細胞產(chǎn)生ERS,并誘導(dǎo)細胞凋亡[2-3]。衣霉素作為ERS的常用誘導(dǎo)劑,通過抑制N-糖基化并阻斷N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶,引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累而誘導(dǎo)ERS[4-5]。人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體(hUC-MSC-Exo)攜帶著蛋白分子、mRNA、微RNA及長鏈非編碼RNA等作為細胞與細胞通信之間的聯(lián)系[6]。研究表明,hUC-MSC-Exo通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)信號通路的激活而抑制腎小管上皮細胞的凋亡[7]。MSC-Exo通過上調(diào)miR-146b的水平從而抑制NF-κB活性和減輕炎癥反應(yīng),降低膿毒癥相關(guān)的AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平,抑制了腎小管細胞凋亡[8]。盡管MSC-Exo顯示出腎臟保護作用,但MSC-Exo對ERS狀態(tài)下腎小管上皮細胞的作用機制尚未闡明。本研究旨在研究ERS狀態(tài)下MSC-Exo對腎小管上皮細胞凋亡的調(diào)控,現(xiàn)報道如下。
材料與方法
一、材 料
1. 試 劑
衣霉素購自瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM購自美國Hyclone公司。胎牛血清、 抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、GRP94、C/EBP同源蛋白(CHOP)、裂解的核糖聚合酶(c-PARP)、CD9、CD81、脂筏結(jié)構(gòu)蛋白1(Flotin1)、 β-肌動蛋白(β-actin)、兔抗IgG、鼠抗IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。流式抗體CD63、CD9、CD81購自Biolenged公司。二辛可寧酸(BCA) 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司。基于Luminol 的增強化學(xué)發(fā)光(ECL)底物試劑蛋白顯色液購自德國Advansta公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒購自美國Biolenged公司。細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)細胞增殖檢測試劑盒購自美國MedChem公司。Adamas life刃天青(resazurin)細胞活性檢測染料購自上海泰坦科技股份有限公司。ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司。
2. 細 胞
人腎小管上皮細胞(HKC)細胞由中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供;hUC-MSC由福建省干細胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供,取P3代細胞進行研究。
二、方 法
1. 細胞培養(yǎng)
hUC-MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的低糖培養(yǎng)基中;腎小管上皮細胞HKC培養(yǎng)于10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基中,細胞均置于含體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中。
2. 臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體的分離
按文獻[9]方法操作:取P3代的hUC-MSC,無血清純DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集上清,經(jīng)3 000×g 15 min離心去除細胞碎片,按照ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒的說明書,將10 mL上清液與2 mL ExoQuick-TC試劑輕輕混合,于4℃過夜(至少12 h),在孵育期間離心管保持直立且不能搖動。經(jīng)1 500×g離心30 min吸棄上清液,1 500×g離心5 min后,輕輕吸棄所有的液體,避免干擾到底部的外泌體沉淀。最后經(jīng)100~500 μL無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸即可得到外泌體溶液。
3. 不同濃度衣霉素對細胞存活的影響
采用CCK-8法:HKC正常傳代培養(yǎng),胰酶消化后鏡下計數(shù)細胞,5 000個/孔接種于96孔板,次日用含0.5%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基將衣霉素稀釋成不同的濃度(0、1、2、4 μg/mL),每孔100 μL,培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h,將96孔板置于酶標儀上,測定450 nm處吸光度值,以對照組為100%,則細胞存活率=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。
4. 不同濃度外泌體對細胞增殖的影響
每孔5 000個HKC接種于96孔板中,次日加入不同濃度[0(Con)、40、60、80、100、150、200 μg/mL]外泌體或2 μg/mL衣霉素作用24 h后,按照上述CCK-8法測定450 nm吸光度。
5. resazurin法檢測細胞增殖活性
每孔5 000個HKC接種于24孔板中,次日實驗分組為對照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組,作用24 h后,每孔加入30 μL的resazurin溶液,在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后,在590 nm處測定熒光強度。
6. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達
各組收集的總蛋白用BCA法檢測總蛋白濃度,隨后取30 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。室溫下4%牛血清白蛋白BSA搖床上封閉1 h后,與1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20(TBST)洗膜3次,加入不同比例稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,室溫孵育1 h,經(jīng)TBST、PBS各洗膜3次后,加入ECL發(fā)光液孵育3 min后進行曝光顯影。各蛋白表達量均以 β-actin為內(nèi)參。
7. 流式熒光激活細胞分選術(shù)檢測細胞凋亡
HKC經(jīng)不同濃度衣霉素或與外泌體聯(lián)合處理24 h,胰酶消化后收集細胞沉淀,經(jīng)預(yù)冷的細胞染色液洗滌2次,加入試劑盒中的結(jié)合液重懸至細胞濃度為1×107/mL。每管吸取100 μL的細胞懸液,加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶(PI)混勻后避光染色15 min。每管加入400 μL 結(jié)合液重懸后即上機檢測。同時設(shè)置正常組細胞不染色調(diào)電壓,經(jīng)FITC Annexin Ⅴ和PI分別單染的細胞調(diào)補償。
8. 流式細胞術(shù)檢測外泌體表面標志物
將提取的40 μL外泌體與5 μL硫酸鹽微珠室溫共孵育15 min,加入5 μL 100 μmol/L的BSA溶液,室溫孵育15 min。加入1 mL PBS孵育75 min,580×g離心5 min,棄上清液。將外泌體微珠(beads)的結(jié)合體中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室溫孵育30 min,經(jīng)離心PBS洗滌2次后,重懸在350 μL PBS中,每管50 μL分裝于流式管中,加入CD9、CD63、CD81的一抗(1∶200)避光孵育45 min,離心重懸后立即上機檢測。
三、統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS 16.0分析結(jié)果,CCK-8法檢測細胞增殖活性,每個濃度5個復(fù)孔,取各濃度的平均值進行分析;熒光強度檢測重復(fù)3次,每次3個復(fù)孔;流式細胞術(shù)分析3次重復(fù)實驗的數(shù)據(jù),取各次實驗的均值為最后結(jié)果。連續(xù)變量以表示,多組間比較使用單因素方差分析,多重比較使用Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
一、衣霉素誘導(dǎo)HKC細胞產(chǎn)生ERS并誘導(dǎo)凋亡
不同濃度衣霉素(0、1、2、4 μg/mL)作用HKC 24 h的細胞存活率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F = 26.650,P = 0.001),隨后使用Dunnett-t檢驗顯示,1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制細胞增殖(P均< 0.05),且細胞存活率隨著衣霉素濃度增加呈下降趨勢(圖1A)。1、2、4 μg/mL衣霉素均能誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白GRP78、GRP94和CHOP表達上調(diào)(圖1B),2、4 μg/mL衣霉素誘導(dǎo)下的細胞凋亡早期標志物c-PARP蛋白表達增強(圖1C);流式細胞術(shù)顯示,不同濃度衣霉素(0、1、2、4 μg/mL)作用HKC 24 h的細胞凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F = 59.960,P < 0.001),且1、2、4 μg/mL衣霉素作用下HKC凋亡加重(P均< 0.05),其中1、2、4 μg/mL衣霉素作用于HKC 24 h的細胞凋亡率分別為(6.32±0.23)%、(11.29±2.89)% 和(18.03±0.21)%(圖1D)。
二、hUC-MSC外泌體的鑒定
蛋白免疫印跡分析顯示,常氧及缺氧培養(yǎng)條件下hUC-MSC外泌體均共表達CD9、CD81和Flotin1這些外泌體的代表性標志物。流式細胞術(shù)檢測進一步證實來源于hUC-MSC外泌體中CD9(59.2%)、CD63(73.4%)和CD81(63.5%)均呈陽性表達。見圖2。
三、hUC-MSC-Exo對HKC細胞增殖和凋亡的影響
不同組別作用HKC 24 h的細胞增殖活性總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F = 449.200,P < 0.001),隨后使用Dunnett-t檢驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比,加入40、60、80 μg/mL外泌體未明顯促進HKC的細胞增殖活性,而加入100 μg/mL 外泌體處理的HKC細胞增殖活性為113.41%(P = 0.006);經(jīng)150 μg/mL和200 μg/mL 外泌體處理HKC細胞增殖活性分別為122.51%(P = 0.004)和141.68%(P = 0.001),見圖3A。resazurin法檢測細胞活性結(jié)果表明,衣霉素2 μg/mL組的熒光強度低于對照組(P = 0.002),而衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的熒光強度高于衣霉素組(P =0.012),見圖3B、C。對照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的細胞凋亡率分別為(0.18±0.01)%、(14.16±1.58)%、(8.18%±0.58)%,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F = 152.000,P < 0.001),對照組與衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL組與衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均< 0.05),見圖3D。
討論
腎臟缺氧/缺血、重金屬毒性、抗癌免疫抑制藥及急慢性炎癥反應(yīng)等多種因素均是AKI的誘因,最終都會導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷,嚴重的損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡[10-11]。ERS和AKI之間的關(guān)系已被體外和體內(nèi)實驗所證實,AKI患者的腎活檢中,ERS標志分子物表達與AKI的嚴重程度密切相關(guān)[12]。腎臟缺血再灌注后近端小管細胞Grp78蛋白表達快速增加,誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)啟動,在缺血損傷初期發(fā)揮保護作用,在嚴重ERS的狀態(tài)下通過CHOP促進caspase的級聯(lián)反應(yīng)凋亡信號通路,促進細胞凋亡[1]。
MSC-Exo在治療AKI中起重要作用,然而,MSC-Exo對ERS誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的分子機制研究還很局限,因此研究MSC-Exo對ERS誘導(dǎo)的腎損傷的分子機制具有重要的現(xiàn)實意義。本研究中不同濃度的衣霉素(1、2、4 μg/mL)均能誘導(dǎo)HKC細胞產(chǎn)生ERS,相關(guān)的分子GRP78、GRP94和CHOP表達上調(diào),并呈濃度依賴性;流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也表明ERS狀態(tài)下能誘導(dǎo)HKC細胞凋亡。hUC-MSC-Exo處理組能明顯增強細胞增殖活性;衣霉素誘導(dǎo)組細胞凋亡率為(14.16±1.58)%,而外泌體與衣霉素共處理組細胞凋亡率為(8.18±0.58)%,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。筆者所在課題組的前期研究表明,hUC-MSC-Exo能通過攜帶的miR-21抑制ERS和p38 MAPK的磷酸化,從而減緩ERS并明顯降低了胰島內(nèi)皮細胞的凋亡率[13]。本研究結(jié)果進一步表明,hUC-MSC-Exo能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡,從而在AKI中發(fā)揮保護作用。
已有研究發(fā)現(xiàn),MSC-Exo可通過激活A(yù)KT和ERK信號通路,減輕髓核細胞ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡[14]。Buono等[15]以衣霉素誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細胞ERS為模型,MSC釋放的細胞外囊泡(EV)能夠誘導(dǎo)人角膜內(nèi)皮細胞中ERS相關(guān)基因ATF4、GRP78、XBP1、CHOP顯著下調(diào),并抑制caspase-3蛋白的表達,其機制是通過MSC-EV中與ERS靶向性的微RNA分子,如miR-222-3p、miR-125b-5p、miR-21-5p轉(zhuǎn)移至角膜內(nèi)皮細胞而發(fā)揮潛在的治療作用。Xie等[16]的研究表明MSC-Exo中miR-31-5p負調(diào)節(jié)ERS分子ATF6,通過miR-31-5p/ATF6/ER應(yīng)激通路調(diào)節(jié)抑制椎體終板軟骨細胞凋亡和鈣化,這表明MSC-Exo在不同的ERS模型中均發(fā)揮一定的抗凋亡作用。本研究中,在ERS狀態(tài)下,MSC-Exo可以減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡,但外泌體發(fā)揮作用的信號通路及外泌體中的何種成分參與了ERS的調(diào)控將是我們下一步研究中要關(guān)注的重點。
綜上所述,本研究表明hUC-MSC-Exo能明顯抑制ERS狀態(tài)下腎小管上皮細胞凋亡。
參 考 文 獻
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(收稿日期:2022-09-30)
(本文編輯:林燕薇)