李欣芳,地里呼瑪爾·吐魯洪,高虹宇,王少華

0 引 言

甲狀腺是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺,位于頸前正中偏下,呈H形。甲狀腺癌是起源于濾泡上皮細(xì)胞或?yàn)V泡旁C細(xì)胞的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率迅速提高。2020年甲狀腺癌世界范圍內(nèi)發(fā)病率高居第9位,男女發(fā)病率之比約1∶4[1-2]。乳頭狀癌是常見的甲狀腺癌類型,預(yù)后良好,10年生存率超過90%～95%[3]。然而,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)初診患者常伴有中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)生率高達(dá)30%～80%。術(shù)前準(zhǔn)確預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于確定 PTC 患者最佳手術(shù)范圍、減少疾病持續(xù)性或復(fù)發(fā)性、避免再手術(shù)并發(fā)癥及改善預(yù)后等具有重要意義[4-5]。

肺表面活性蛋白B(pulmonary surfactant-associated protein B, SFTPB/SPB)是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌的一類疏水性脂蛋白,在降低肺泡表面張力和宿主免疫防御方面發(fā)揮重要作用[6-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),SFTPB不僅在維持正常生理功能上發(fā)揮作用,也與炎癥性和腫瘤性疾病有關(guān)[9-11]。通過公共數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)SFTPB在甲狀腺癌中存在高表達(dá),并通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因在肺癌中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,由此猜測(cè)SFTPB在PTC中可能存在類似作用,并對(duì)此假設(shè)行進(jìn)一步深入探索[12]。

本研究旨在通過比較PTC癌組織與癌旁正常組織中SFTPB的表達(dá)情況,及進(jìn)一步比較中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移患者該基因的差異表達(dá),探討SFTPB在預(yù)測(cè)該類患者病理良惡性及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用價(jià)值;同時(shí)對(duì)術(shù)前cN0的患者是否需行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2018年6月29日-2022年6月2日于我科首診并行手術(shù)治療的共計(jì)123例PTC患者的臨床病理基線資料及手術(shù)標(biāo)本。收集指標(biāo)包括符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者的姓名、住院號(hào)、性別、年齡、腫瘤最大徑(cm)、有無中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移數(shù)目、是否合并橋本氏甲狀腺炎、有無BRAF基因突變、是否為多灶性腫瘤、術(shù)前TSH值(正常值范圍0.49～4.5 mIU/L)、TNM分期(AJCC第7版)、臨床分期及取材日期。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)式為甲狀腺全切及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃;②術(shù)后病理證實(shí)為PTC;③術(shù)前檢查未提示有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;④無其他惡性腫瘤病史;⑤無甲狀腺、頸部手術(shù)及放射史;⑥臨床、病理基線資料收集完整者;⑦術(shù)后癌組織(及癌旁組織)標(biāo)本保存完好者;⑧HE、IHC染色后顯微鏡視野中存在足量腫瘤細(xì)胞者。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后復(fù)發(fā)于我院再次行手術(shù)治療者;②未行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃或僅行單側(cè)腺葉切除及單側(cè)VI區(qū)淋巴結(jié)清掃患者。經(jīng)排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后共計(jì)有效病例104例,共計(jì)有效標(biāo)本175件(其中成對(duì)標(biāo)本71件,單癌標(biāo)本33件)。

1.2研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑SFTPB兔抗人多克隆抗體購買自proteintech?公司(Catalog Number13664-1-AP),SP試劑及DAB顯色試劑盒購買自Solarbio?生物公司(貨號(hào) SP0021)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法所有石蠟標(biāo)本以4 μm厚度行連續(xù)切片并于60 ℃烤箱中烤片不少于2 h。經(jīng)二甲苯I、II中脫蠟10 min,后依次于無水酒精、90%、80%、70%濃度酒精中浸泡5 min水化。免疫組化染色采用En Vison兩步法:檸檬酸鹽緩沖液高壓下抗原熱修復(fù),PBS、PBST溶液依次清洗各5 min。室溫下封閉液封閉1 h后,按推薦濃度1∶50稀釋SFTPB兔多克隆抗體,以50 μL體積孵育標(biāo)本,4 ℃過夜。PBS、PBST清洗后,依次滴加1∶100稀釋濃度的Bio-羊抗兔二抗、鏈霉親和素-POD工作液各50 μL,孵育30 min后清洗。滴加DAB顯色液后于顯微鏡下觀察染色情況,顯色約10 min后終止;再行蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水透明后用中性樹膠封片。干燥后于顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取不少于5個(gè)視野拍照,最后根據(jù)圖片中目的蛋白表達(dá)量行人工半定量評(píng)分及Image-Pro Plus軟件(Version 6.0.0版本)定量評(píng)分。

1.2.3結(jié)果判讀SFTPB蛋白陽性著色主要定位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),陽性染色呈棕黃色或棕褐色[13-14]。

1.2.4半定量評(píng)分染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:0分為陰性著色;1分為淡黃色;2分為淺褐色;3分為深褐色。染色范圍計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:0～25%為1分;26%～50%為2分;51%～75%為3分;76%～100%為4分。評(píng)分記為2項(xiàng)指標(biāo)的乘積,取5個(gè)視野下評(píng)分的均值作為最后得分。0～3.0分記為陰性(-),3.1～6.0記為弱陽(+),6.1～9.0記為陽(2+),9.1～12.0記為強(qiáng)陽(3+)。染色結(jié)果判讀由2位研究者獨(dú)立完成。

1.2.5Image-Pro Plus定量評(píng)分所得圖片經(jīng)IPP軟件進(jìn)行光密度校正,手動(dòng)選取視野下所有陽性顏色區(qū)域,所獲取的累積光密度值(integrated optical density,IOD)除以有效目標(biāo)分布區(qū)域面積總和即為平均光密度值(average optical density,AOD),取5個(gè)視野下的平均值作為最后得分。

1.3生物信息學(xué)分析于TCGA公共數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載有關(guān)甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理資料,采用limma包進(jìn)行PTC癌組織和癌旁組織SFTPB表達(dá)量的配對(duì)分析。利用GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn)在線網(wǎng)站進(jìn)行SFTPB高、低表達(dá)組的DFS生存差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理基線資料本研究共計(jì)收集104例患者有效臨床病理信息及手術(shù)標(biāo)本。根據(jù)是否發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將納入研究患者分為轉(zhuǎn)移組(n=70)和未轉(zhuǎn)移組(n=34)。組間患者性別、年齡、腫瘤最大徑、多灶性、臨床分期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表 1 104例PTC患者的臨床病理基線資料Table 1 Clinicopathological baseline data of 104 patients with PTC

2.2SFTPB在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)通過對(duì)71對(duì)PTC癌組織與相應(yīng)癌旁組織樣本的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),癌中SFTPB的表達(dá)量明顯高于正常組織,見圖1。其中,在半定量評(píng)分比較標(biāo)準(zhǔn)中,癌組織中目的蛋白陰性表達(dá)者2例(2.8%),陽性表達(dá)者69例(97.2%);癌旁組織中目的蛋白陰性表達(dá)者為66例(93%),陽性表達(dá)者5例(7%)。在定量評(píng)分比較中,癌組織的目的蛋白表達(dá)量為42.58±21.71,癌旁組織樣本為10.56±6.31,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖 1 PTC癌組織、癌旁組織的HE染色及免疫組化染色Figure 1 HE staining and immunohistochemical staining of PTC cancer tissues and para-cancerous tissues

為擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證以上結(jié)論的準(zhǔn)確性,對(duì)比分析了TCGA網(wǎng)站上的公共數(shù)據(jù),同樣發(fā)現(xiàn)配對(duì)樣本中癌組織的SFTPB表達(dá)量高于癌旁組織,且SFTPB高表達(dá)組較低表達(dá)組的預(yù)后(DFS)更差(P=0.038)。見圖2。

a:SFTPB表達(dá); b:生存率圖 2 基于公共數(shù)據(jù)庫的SFTPB的差異表達(dá)和預(yù)后意義Figure 2 Differential expression and prognostic value of SFTPB based on public database

2.3SFTPB與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系存在中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC(n=70)較中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(n=34)而言,SFTPB蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步增加。其中,在半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)中,轉(zhuǎn)移組的目的蛋白表達(dá)陽/強(qiáng)陽表達(dá)者為50例(71%),陰/弱陽表達(dá)者為20例(29%);未轉(zhuǎn)移組中目的蛋白陽/強(qiáng)陽性表達(dá)者為3例(9%),陰/弱陽表達(dá)者為31例(91%)。在定量評(píng)分中,轉(zhuǎn)移組的目的蛋白表達(dá)量為48.45±19.07,未轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量為25.29±9.69(P<0.001)。提示SFTPB的表達(dá)量升高可能對(duì)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有驅(qū)動(dòng)作用。

2.4PTC患者臨床病理特征與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系單因素邏輯回歸分析顯示,性別(P<0.001)、年齡(P=0.004)、多灶性(P=0.027)、SFTPB半定量(P<0.001)、SFTPB定量(P<0.001)是頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)臨床病理因素;多因素

分析結(jié)果進(jìn)一步提示,性別(P=0.045)、年齡(P=0.034)、SFTPB半定量(P=0.021)、SFTPB定量(P=0.028)是頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因素。其中,男性、年齡≤45歲、SFTPB高表達(dá)患者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高,為預(yù)后不良因素。見表2。

表 2 PTC頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理參數(shù)的單因素和多因素Logistic回歸分析Table 2 Univariate and multivariate logistic regression analysis of clinicopathological parameters related to lymph node metastasis in the central region of the neck of PTC

2.5基于獨(dú)立預(yù)后因素構(gòu)建患者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)模型通過四個(gè)因素(性別、年齡、SFTPB半定量、SFTPB定量)構(gòu)建的列線圖所示,SFTPB表達(dá)量在圖中顯示為預(yù)測(cè)甲狀腺癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最有效的指標(biāo),見圖3;且表達(dá)水平越高其預(yù)測(cè)效能越佳。其他如性別、年齡也可對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)行一定預(yù)測(cè)。在ROC曲線中,SFTPB半定量與定量的曲線下面積分別為0.922和0.929,顯示出良好的預(yù)測(cè)性能,上述結(jié)論在決策曲線中同樣得到驗(yàn)證,展現(xiàn)了SFTPB在預(yù)測(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上良好的臨床效用性,提示SFTPB有望成為PTC患者的新型診斷標(biāo)志物,并在預(yù)測(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮有效作用,見圖4。

a:SFTPB半定量; b:SFTPB定量圖 3 SFTPB蛋白在癌旁組織、pN0、pN1各組中的表達(dá)量比較Figure 3 Comparison of the expression of SFTPB in the para-cancerous , pN0 and pN1 groups

a:由性別、年齡、SFTPB半定量與定量4因素建立的預(yù)測(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的列線圖;b:基于列線圖的預(yù)測(cè)模型校準(zhǔn)曲線;c:評(píng)估預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確性的ROC曲線圖;d:評(píng)估預(yù)測(cè)模型效用性的DCA曲線圖圖 4 相關(guān)臨床病理因素對(duì)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)效能Figure 4 Predictive efficacy of relevant clinicopathological factors about central lymph node metastasis

3 討 論

隨著常規(guī)體檢的普及和影像學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步,甲狀腺癌的發(fā)病率迅速增高,其中又以甲狀腺微小癌尤甚。甲狀腺癌以PTC最為常見,占80%～85%。甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后良好,但臨床上易早期發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)生率可高達(dá)30%～80%[15-16]。盡管頸部淋巴結(jié)清掃已在臨床廣泛開展,但就是否行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃以及清掃范圍,則一直存在爭(zhēng)議。雖然預(yù)防性的清掃可以獲得準(zhǔn)確的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息,但卻增加了短暫性/長久性的喉返神經(jīng)損傷及甲狀旁腺功能減退的發(fā)生率,且沒有足夠的證據(jù)表明預(yù)防性的手術(shù)清掃可使患者遠(yuǎn)期生存獲益[17-18]。在手術(shù)范圍上,我們力爭(zhēng)既要避免因淋巴結(jié)清掃范圍不足而導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā),也要避免因清掃范圍過度而損傷患者旁腺及發(fā)聲功能,以及影響患者正常的頸部活動(dòng)和局部美觀性[19-20]。因此,甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)清掃范圍亟待規(guī)范。

人SFTPB基因位于2號(hào)染色體上,其編碼的蛋白全長由381個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,相對(duì)分子質(zhì)量為42 000。SFTPB主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成和分泌,是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的重要組成成分,存在于哺乳動(dòng)物肺泡表面氣-液交界處,在維持正常呼吸功能、防止肺泡塌陷和免疫病原微生物感染方面起重要作用[21-23]。該蛋白同時(shí)與機(jī)體病理過程息息相關(guān),如文獻(xiàn)報(bào)道SFTPB低表達(dá)或功能異常與新生兒呼吸窘迫綜合征、成人急性呼吸窘迫綜合征/急性肺損傷以及老年人慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[24-28]。近年來,也有相關(guān)文獻(xiàn)表明SFTPB的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生或預(yù)后也存在關(guān)聯(lián)。管鑫等[29]通過分子結(jié)構(gòu)分析與化學(xué)預(yù)測(cè)證明SFTPB基因失調(diào)對(duì)肺鱗癌的易感性;Moreno-Rubio等[30]通過對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者的多中心SFTPB轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),SFTPB mRNA低表達(dá)與患者的3年OS降低有關(guān);Zhu等[31]對(duì)公共數(shù)據(jù)庫中經(jīng)免疫治療的肺腺癌患者行凋亡相關(guān)基因差異分析發(fā)現(xiàn),SFTPB表達(dá)量與預(yù)期生存存在正性相關(guān)。因此,本研究擬探索SFTPB在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況及相關(guān)臨床意義,豐富該基因在甲狀腺腫瘤領(lǐng)域的研究。

本研究通過分析2018年6月至2022年6月于我科行手術(shù)治療的104例PTC患者的手術(shù)標(biāo)本及相關(guān)臨床病理信息,免疫組化實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其SFTPB蛋白表達(dá)量對(duì)比發(fā)現(xiàn),癌旁正常組織、癌組織不伴中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織伴中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3組標(biāo)本的目的蛋白表達(dá)量存在顯著差異,提示SFTPB在PTC癌組織中表達(dá)量升高,并可能與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。進(jìn)一步經(jīng)回歸分析驗(yàn)證SFTPB表達(dá)量與患者性別、年齡共同構(gòu)成PTC患者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素。同時(shí),我們使用Kaplan-Meier法分析TCGA共同數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),SFTPB的高水平表達(dá)與患者的不良預(yù)后亦存在關(guān)聯(lián)。

本研究也存在一定的局限性:首先,本研究為單中心數(shù)據(jù),樣本量偏小,可能使結(jié)果存在一定誤差;并且,本研究收集到的存在包膜侵犯、血管/神經(jīng)侵犯、腺體外腫瘤結(jié)節(jié)形成的病例較少,故未納入統(tǒng)計(jì)變量當(dāng)中。其次,本研究中使用的手術(shù)標(biāo)本時(shí)間跨度偏長,可能存在由于樣本保存條件不當(dāng)而使部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差的問題。最后,本研究僅考慮了目的蛋白SFTPB與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能關(guān)系,而未考慮其可能與頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能相關(guān)性,以上均有待在后續(xù)研究中進(jìn)行改進(jìn)或完善,以期為臨床診療提供有效參考。

綜上,甲狀腺乳頭狀癌患者SFTPB蛋白表達(dá)量上調(diào),且PTC合并頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者SFTPB表達(dá)水平較非轉(zhuǎn)移者進(jìn)一步升高。這預(yù)示SFTPB有望成為PTC潛在的診斷標(biāo)志物,且在指導(dǎo)是否對(duì)cN0的患者行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃中發(fā)揮一定作用,有利于降低患者復(fù)發(fā)率或避免過度醫(yī)療。