趙思陽(yáng) 阮成江 丁健 盧順光 溫秀鳳 胡建忠

(大連民族大學(xué),大連,116600) (水利部沙棘開發(fā)管理中心)

沙棘(Hippophaerhamnoides)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木,耐寒抗旱的木本糧油樹種。沙棘種子油中富含不飽和脂肪酸(如油酸(15.8%～32.8%)、亞油酸(21.7%～45.9%)、亞麻酸(14.1%～23.4%)、黃酮、甾醇等活性物質(zhì)),具有預(yù)防和治療癌癥、抗氧化、抗衰老等功能[1]。甘油三酯(TAG)是木本油料樹種種子儲(chǔ)存脂質(zhì)的主要形式,沙棘種子含油率僅為7%～11%,遠(yuǎn)不能滿足全球日益擴(kuò)大的沙棘種子油的需求。甘油-3-磷酸(G3P)是TAG合成的前體物質(zhì)[2-3],甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD1)將二羥基丙酮還原為甘油-3-磷酸,是糖酵解途徑中的重要部分,也是促進(jìn)油脂合成前體G3P合成的限速酶,直接影響3-磷酸甘油和甘油三酯水平[4-5]。Vigeolas et al.[6]在油菜中過表達(dá)甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD1)酵母基因,發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的種子中甘油-3-磷酸的水平增加了3～4倍,種子脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加40%。Liu et al.[7]在煙草中過表達(dá)油菜BnGPDH基因,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株的煙草種子含油量顯著增加了4%。Kennedy通路是?；o酶A依賴性反應(yīng),也是是大多數(shù)植物合成TAG的主要途徑[8]。在種子發(fā)育過程中,二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)通過將脂肪酰鏈從?；o酶a轉(zhuǎn)移到sn-1,2-甘油二酯的sn-3位置,催化肯尼迪途徑TAG合成的最后一步,因此,DGAT被認(rèn)為是種子貯藏過程中油脂積累的重要酶[9-10]。Banilas et al.[11]研究發(fā)現(xiàn)橄欖DGAT1基因有助于種子油脂的合成,而基因DGAT1與DGAT2共表達(dá)有助于中果皮油脂的積累;Zhao et al.[12]揭示大豆基因GmDGAT1A和GmDGAT1B的組成性表達(dá)導(dǎo)致種子油含量增加;在微綠球藻中過表達(dá)擬南芥DGAT導(dǎo)致總脂質(zhì)和TAG含量顯著增加,且C16(C16:0+C16:1)急劇升高,C18(C18:0+C18:1)略有下降[13]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,將多個(gè)基因構(gòu)建于一個(gè)植物表達(dá)載體,是實(shí)現(xiàn)多基因組裝與轉(zhuǎn)化的策略之一[14-15]。Chhikara et al.[16]將擬南芥二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1(DGAT1)和酵母甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD1)基因在亞麻薺種子中共表達(dá),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株種子含油率升高了8%～13%,油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低26%,亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高23%。

沙棘種子發(fā)育期油脂合成積累源于源基因GPD1和匯基因DGAT的協(xié)同表達(dá)[17]。因而,調(diào)控GPD1和DGAT基因在提高種子含油量方面有潛在效果。本研究旨在成功構(gòu)建沙棘油脂合成關(guān)鍵基因GPD1和DGAT1的雙價(jià)載體pCAMBIA1301-HrGPD1-HrDGAT1,通過擬南芥異源表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株脂肪酸不同組份的比例和含油率進(jìn)行測(cè)定,驗(yàn)證共表達(dá)HrGPD1和HrDGAT1對(duì)沙棘種子品質(zhì)的影響,為培育高品質(zhì)沙棘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取大連民族大學(xué)校園內(nèi)的沙棘‘實(shí)優(yōu)1號(hào)’的種子為研究對(duì)象,選用野生型擬南芥(Col-0)作為目的基因的轉(zhuǎn)化受體。

1.2 沙棘GPD1和DGAT1基因的克隆

Trizol法提取沙棘‘實(shí)優(yōu)1號(hào)’種子的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,RT-PCR擴(kuò)增GPD1、DGAT1基因的CDS區(qū),擴(kuò)增GPD1基因的引物添加KpnI酶切位點(diǎn),擴(kuò)增DGAT1基因的引物分別添加BglII和BstEII酶切位點(diǎn)(見表1)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR擴(kuò)增)程序:95 ℃(30 s),39個(gè)循環(huán):95 ℃(15 s)、51 ℃(15 s)、72 ℃(1 min),72 ℃(5 min)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(見圖1),切膠回收純化目的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶后進(jìn)行測(cè)序。

表1 目的基因引物序列

M為DL2000 DNA標(biāo)識(shí);A1為GPD1 PCR產(chǎn)物;B1為DGAT1 PCR產(chǎn)物。

1.3 雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切酶KpnI單酶切載體pCAMBIA1301-KY使其線性化,酶切產(chǎn)物純化后用ClonExpress-II One Step Cloning Kit(ClonExpress-II一步克隆試劑盒,諾維贊生物)與HrGPD1基因的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行同源重組,取In-Fusion重組產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞,涂布平板,37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒,同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序,測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確后提取質(zhì)粒pCAMBIA1301-HrGPD1。將pCAMBIA1301-HrGPD1質(zhì)粒用BglII和BstEII雙酶切使其線性化,酶切產(chǎn)物純化后與HrDGAT1基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng),重組反應(yīng)與HrGPD1基因連接相同的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證步驟,測(cè)序比對(duì)正確后得到質(zhì)粒pCAMBIA1301-HrGPD1-HrDGAT1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0),取適量野生擬南芥種子(T0)經(jīng)潮霉素(質(zhì)量濃度20 mg/L)篩選,選取長(zhǎng)出真葉并能生根的抗性苗移栽,移栽苗正常開花后,取適量葉片提取DNA,以野生型擬南芥(Col-0)的cDNA作為對(duì)照(WT),檢測(cè)引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列(見表1),上游統(tǒng)一用pCAMBIA1301-KY載體中的啟動(dòng)子片段35S-F。PCR擴(kuò)增HrGPD1、HrDGAT1基因,電泳后按正確條帶確定陽(yáng)性植株。

1.4 目的基因熒光定量PCR分析方法

取適量轉(zhuǎn)基因一代(T1)擬南芥植株的葉片提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以野生型擬南芥的cDNA作為對(duì)照,以擬南芥actin(AT-actin,表1)為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR擴(kuò)增檢測(cè),確定HrGPD1和HrDGAT1同時(shí)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)。所用的熒光試劑為AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix(Vazyme # Q111-02/AA)。PCR反應(yīng)體系為10 μL。每個(gè)植株樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s;40 ℃ 5 min。目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用鄧肯檢驗(yàn)分析組間差異性。

1.5 轉(zhuǎn)基因T2擬南芥種子含油率測(cè)定

收取pCGD-11擬南芥株系的T2代純合株系擬南芥的種子,采用氯仿甲醇法[18]測(cè)定種子含油率。以野生型擬南芥種子作為對(duì)照,每份種子為0.2 g,設(shè)置3次重復(fù)。種子干燥后研磨,稱取粉末質(zhì)量為m,加入2 mL甲醇和4 mL氯仿渦旋混勻2 min,超聲30 min后離心,取上清加入1/4體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.88%氯化鉀溶液,混勻靜置30 min,收集下層溶液加入到已知質(zhì)量(m0)的樣品瓶中,揮發(fā)至恒質(zhì)量后,稱量油的質(zhì)量(m1),含油率=(m1-m0)/m。

1.6 轉(zhuǎn)基因二代(T2)擬南芥種子脂肪酸組分及比例測(cè)定

采用先皂化后甲酯化的方法對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定分析。甲酯化根據(jù)丁健等[19]的方法,適當(dāng)改進(jìn)。以野生型擬南芥種子作為對(duì)照,設(shè)置3個(gè)重復(fù),取1.5節(jié)提取的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子油1 μL于4 mL貯樣瓶,加200 μL正己烷,振蕩溶解樣品,加入500 μL濃度1 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液(現(xiàn)配),充分振蕩;密封后,60 ℃水浴30 min,期間振蕩2～3次,冷卻;加入1 mL三氟化硼甲醇溶液,密封后,再于60 ℃水浴30 min,期間振蕩2～3次,冷卻;加入1 mL飽和氯化鈉溶液和2 mL正己烷,劇烈振蕩1 min,靜置,分層后,收集上層溶液,加入新離心管;取適量無水硫酸鈉加入離心管振蕩干燥,靜置;抽取上層清液過0.22 μm有機(jī)膜,用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行脂肪酸組分分析。

GC-MS條件:采用DB-23色譜柱(60.00 m×0.25 mm,模厚0.25 μm),進(jìn)樣口溫度230 ℃,載氣流速1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流比40∶1。柱箱升溫程序:溫度50 ℃以15 ℃/min升溫至200 ℃,保持15 min;以3 ℃/min升溫至215 ℃,保持10 min;以3 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min。離子源(EI)溫度230 ℃,傳輸線溫度245 ℃,檢測(cè)電壓1 700 V,溶劑延遲5 min,質(zhì)量掃描范圍(m/z)45～400 u。根據(jù)37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品建立的質(zhì)譜庫(kù)對(duì)樣品定性分析,采用峰面積歸一化法[20]對(duì)脂肪酸進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘GPD1和DGAT1雙基因載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

以沙棘種子發(fā)育20 d的種子cDNA為模板,PCR擴(kuò)增GPD1和DGAT1基因,電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出975和1 608 bp的條帶(見圖1)。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,通過擬南芥蘸花法侵染野生型擬南芥,取適量T0代種子經(jīng)潮霉素篩選(見圖2A),選取長(zhǎng)出真葉并能生根的抗性苗移栽(見圖2B)。擬南芥移栽苗正常開花后,取T1代轉(zhuǎn)基因植株的葉片提取DNA,以野生型擬南芥(WT)的cDNA作為對(duì)照,PCR分別擴(kuò)增HrGPD1、HrDGAT1基因,共獲得18株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥植株(見圖3),經(jīng)測(cè)序結(jié)果比對(duì),表明HrGPD1和HrDGAT1克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-ky中,成功構(gòu)建雙價(jià)共表達(dá)載體pCMABIA1301-HrGPD1-HrDGAT1(pCGD)(見圖4)。

圖2 擬南芥轉(zhuǎn)基因pCAMBIA-GPD1-DGAT1抗性篩選及抗性苗移栽

A為“A1～A18”為抗性植株GPD1基因PCR檢測(cè)電泳;B為B1～B18”為抗性植株DGAT1基因PCR檢測(cè)電泳;WT為對(duì)照野生型植株;“-”為純水空白對(duì)照;“+”為質(zhì)粒對(duì)照;“M”為DL2000標(biāo)識(shí)。

圖4 pCMABIA1301-HrGPD1-HrDGAT1載體圖譜

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥HrGPD1和HrDGAT1的表達(dá)水平

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得T1代轉(zhuǎn)基因株系(pCGD-1、pCGD-10、pCGD-11)的葉片,以野生型(WT)為對(duì)照,通過qRT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)。由表2可知,沙棘HrGPD1和HrDGAT在pCGD-1和pCGD-11轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的顯著高于對(duì)照表達(dá),表明HrGPD1和HrDGAT共同轉(zhuǎn)入擬南芥植株。在不同的轉(zhuǎn)基因株系中,基因表達(dá)量差異比較大,這與基因的插入位點(diǎn)以及插入的拷貝數(shù)有關(guān)系。

表2 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中HrGPD1(A)和HrDGAT1(B)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3 過表達(dá)pCGD擬南芥的含油率和脂肪酸組分

由表3可知,野生型擬南芥種子油脂中油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)的比例分別為12.57%和33.78%,而轉(zhuǎn)pCGD雙價(jià)基因T2代擬南芥種子中油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)的比例分別為18.44%和36.94%,在擬南芥中共表達(dá)沙棘HrGPD1和HrDGAT1基因,導(dǎo)致油酸和亞油酸分別升高了46.70%和9.35%。野生型擬南芥種子含油率為222.75 mg/g,過表達(dá)pCGD的擬南芥種子含油率則為172.94 mg/g,轉(zhuǎn)雙價(jià)HrGPD1和HrDGAT1基因的擬南芥種子含油率降低了22.36%。

表3 過表達(dá)pCGD擬南芥種子的脂肪酸和含油率

3 討論

重組DNA技術(shù)和植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進(jìn)步對(duì)將外源基因?qū)胫参镆援a(chǎn)生具有改良性狀的轉(zhuǎn)基因植物非常有益。DGAT1通常是種子和果實(shí)含油量和脂肪酸組成的主要決定因素[21-22],控制其基因表達(dá)是增加含油量和改變脂肪組成的有效方法[23]。增加油酸等單不飽和脂肪酸的含量是一個(gè)優(yōu)勢(shì),因?yàn)橛退峋哂醒趸€(wěn)定性和低溫流動(dòng)性等化學(xué)性質(zhì)[24]。大豆GmGPD1的過表達(dá)使大豆油酸顯著增加了31.0%[25],麻風(fēng)樹中過表達(dá)AtDGAT1使種子油酸增加了9%～25%[26],向日葵HaDGAT1在酵母中的表達(dá)導(dǎo)致棕櫚油酸和油酸分別增加了86.6%和81.6%[27]。在萊茵衣藻[28]、油莎草[29]、大豆[30]、亞麻薺[31]、破囊壺菌[32]中過表達(dá)DGAT2提高了油酸比例,說明分別過表達(dá)GPD1、DGAT可以提高種子不飽和脂肪酸的比例。本研究中,成功構(gòu)建了沙棘pCAMBIA1301-GPD1-DGAT1雙基因表達(dá)載體,在擬南芥中異源表達(dá)使擬南芥種子油酸和亞油酸分別提高了46.70%和9.35%,說明GPD1和DGAT1促進(jìn)了不飽和脂肪酸的積累。4個(gè)參與甘油三酯合成和保護(hù)的重要基因(AtDGAT1、AtPDAT、AtWRI1和AtOLE)在水稻的組成性啟動(dòng)子下過表達(dá),油酸和棕櫚酸分別增加了28%和27%[33];Vanherck et al.[34]在煙草中過表達(dá)DGAT1、WRI1和Ole基因,油酸含量顯著增加;在野生型擬南芥中共表達(dá)文冠果XsDGAT1和XsDGAT2,在發(fā)育中期,文冠果轉(zhuǎn)基因植株種子的含油率達(dá)到最大值,且油酸和亞油酸的比例顯著增加[35]。

用RNAi介導(dǎo)的基因沉默和過表達(dá)方法分別生成微綠球藻NoDGAT1a敲除和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系,發(fā)現(xiàn)TAG sn-1/sn-3位置的C16:0、C18:0的降低,以及TAG sn-2位置的C18:1的降低;NoDGAT1A的過表達(dá)導(dǎo)致三酰甘油(TAG)的比例增加了39%,伴隨TAG sn1/sn-3位置的C16:0和C18:0增加,以及TAG sn-2位置的C18:1增加[36]。甘油的sn位置導(dǎo)致脂肪酸種類的差異,種子油存在不同種類的TAG。利用貯存在胞質(zhì)中的?；鵆oA池,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過3種不同?；D(zhuǎn)移酶的作用,合成三酰甘油[37]。飽和脂肪酸通常位于甘油分子的sn-1和sn-3位置,不飽和脂肪酸則大多發(fā)生在sn-2位置,二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶通常作用于sn-3位置[38]。說明DGAT1有助于將飽和及單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)移到真核生物以合成TAG,且過表達(dá)DGAT基因可以引起TAG在sn-1/sn-3和sn-2位置的脂肪酸的比例增加。

DGAT1的高表達(dá)會(huì)影響底物、酶和產(chǎn)物間的關(guān)系,從而導(dǎo)致TAG代謝途徑中的某些底物受到限制從而影響轉(zhuǎn)基因植株種子含油率[39]。本研究中,共表達(dá)沙棘HrGPD1和HrDGAT1使轉(zhuǎn)基因植株種子含油率降低了22.36%。