趙鳳玲，李盼盼，高 翔，羅宇馨，王潤(rùn)萍，高 靜

（1.北京市通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 101100；2.河北北方學(xué)院，河北張家口 075000）

大豆及其制品的蛋白質(zhì)含量居植物蛋白之首，有防癌、護(hù)肝、降血壓、增強(qiáng)免疫力等保健作用[1]，其含有的大豆異黃酮和大豆皂苷在治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、抗腫瘤等方面有積極的效果[2]，越來(lái)越受到消費(fèi)者推崇。但豆制品中所含豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又為微生物提供了理想的生長(zhǎng)條件，如果保存不當(dāng)受到微生物的污染很容易大量增殖，會(huì)給消費(fèi)者的健康帶來(lái)極大的威脅[3]。即食非發(fā)酵豆制品日常消費(fèi)量很大，包括豆腐、豆?jié){、豆絲、豆干、涼拌菜等，因?yàn)槠渲苯尤肟诘奶攸c(diǎn)，致病微生物的污染會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成極大的傷害。本研究基于2020 年底對(duì)北京市通州區(qū)開(kāi)展的一次即食非發(fā)酵豆制品的微生物污染狀況監(jiān)測(cè)，分析了北京市通州區(qū)不同包裝、不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品微生物污染情況，以期為當(dāng)?shù)厥吃葱约膊〉娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 即食非發(fā)酵豆制品樣品采集

利用無(wú)菌操作技術(shù)在北京市通州區(qū)大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、網(wǎng)店采集即食非發(fā)酵豆制品共70 份，采樣量≥250 g/份，大型超市30 份，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)30 份，網(wǎng)店10 份，其中散裝45 份、預(yù)包裝25 份，采樣后立即低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 材料與儀器

革蘭陽(yáng)性/陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板（上海星佰）；沙門(mén)氏菌診斷血清（丹麥SSI）；單增李斯特菌血清分型抗體（日本DenkaSeiken）；致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（北京良潤(rùn)）；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力基因和分型引物，由上海生工合成；AscI和Xba Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶（TAKARA）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；VITEK2 COMPACT30 全自動(dòng)細(xì)菌生化分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；普通PCR 儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）；羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche Diagnostics Ltd）；全自動(dòng)DNA/RNA 分析系統(tǒng)（QIAGEN）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.3 同時(shí)期參比致病菌株

2020 年6 月—12 月北京市通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的沙門(mén)氏菌；2018—2020 年北京市通州區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌病例監(jiān)測(cè)中分離的菌株；2020 年6 月—12 月北京市通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的致瀉大腸埃希氏菌。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目和方法

檢驗(yàn)項(xiàng)目為菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌，均按GB 4789 系列標(biāo)準(zhǔn)[4-9]進(jìn)行檢測(cè)。致病菌鑒定均用全自動(dòng)細(xì)菌生化分析系統(tǒng)VITEK2 COMPACT30。

1.5 致病菌分離株的分析方法

利用血清凝集方法測(cè)定血清型；用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏分析；用PCR 方法分析毒力基因；參考國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)技術(shù)規(guī)范將豆制品中分離的菌株與同時(shí)期通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的同類菌株進(jìn)行PFGE 分子分型。

1.6 結(jié)果判定

1.6.1 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照《 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 面筋制品》（GB 2711—2014）[10]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》（GB 2712—2014）[11]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[12]以及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[13]評(píng)價(jià)豆制品微生物污染情況；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 24.0 軟件，計(jì)數(shù)資料均用率表示，卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6.2 藥物敏感性

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)致病菌的藥敏結(jié)果，獲得相應(yīng)敏感（S）、中度敏感（I）和耐藥（R）的結(jié)果。

1.6.3 PFGE 圖譜

用Bionumerics 7.6 軟件分析菌株間的親緣性，采用非加權(quán)配對(duì)平均法，位置容許度為1.5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食非發(fā)酵豆制品的微生物檢測(cè)情況

樣品共計(jì)70 份，總合格率38.57%（27/70），菌落總數(shù)合格率38.57%（27/70），大腸菌群合格率85.71%（60/70）。致病菌檢出率20.00%（14/70），其中5 株沙門(mén)氏菌（7.14%），4 株單核細(xì)胞增生李斯特菌（5.71%），5 株致瀉大腸埃希氏菌（7.14%）。

2.2 不同包裝即食非發(fā)酵豆制品的檢測(cè)情況

預(yù)包裝菌落總數(shù)合格率顯著高于散裝樣品（χ2=18.341，P＜0.05）；預(yù)包裝大腸菌群合格率稍高于散裝樣品（χ2=2.180，P＞0.05）；預(yù)包裝致病菌檢出率顯著低于散裝樣品（χ2=6.222，P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 不同包裝即食非發(fā)酵豆制品的微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品的檢測(cè)情況

3 類采樣場(chǎng)所樣品的合格率分別為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)20.00%、超市56.67%、網(wǎng)店40.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.520，P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品的檢測(cè)情況

2.4 致病菌分離結(jié)果

2.4.1 沙門(mén)氏菌

（1）血清分型。5 株沙門(mén)氏菌中2 株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌，1 株為腸炎沙門(mén)氏菌，1 株為阿姆斯特丹沙門(mén)氏菌，1 株為德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌。

（2）耐藥情況。受試的15 種抗生素中，所有菌株對(duì)亞胺培南、頭孢西丁、慶大霉素、阿奇霉素和環(huán)丙沙星的敏感率為100%，對(duì)氨芐西林、氨芐舒等呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，見(jiàn)表3。

表3 沙門(mén)氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品中分離沙門(mén)菌株及同時(shí)期腹瀉病例分離沙門(mén)菌株進(jìn)行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于57.3%～100.0%，來(lái)源于市場(chǎng)的3號(hào)豆制品的菌株與來(lái)源于病例的2、3、4、5 號(hào)菌株帶型相似度為88.7%，來(lái)源于市場(chǎng)的1 號(hào)豆制品的菌株與來(lái)源于病例的1 號(hào)菌株帶型相似度達(dá)77.4%，見(jiàn)圖1。

圖1 沙門(mén)氏菌PFGE 圖

2.4.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌

（1）毒力基因及血清分型。分離出的4 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，3 株血清型為1/2a，1 株血清型為1/2b，所有菌株6 對(duì)毒力基因（prfA、plcA、iap、hly、plcB、inlA）均為陽(yáng)性。

（2）耐藥情況。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在受試的15種抗生素中，對(duì)多數(shù)抗生素敏感，但對(duì)苯唑西林、環(huán)丙沙星、頭孢西丁100%耐藥，見(jiàn)表4。

表4 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品分離株及近3 年病例檢測(cè)出的菌株進(jìn)行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于56.9%～90.9%。來(lái)源于豆制品的3 號(hào)帶型與來(lái)源于病例的6 號(hào)帶型只相差2 個(gè)條帶，相似度達(dá)90.9%，與7 號(hào)帶型相差3 個(gè)條帶，相似度達(dá)86.4%；來(lái)源于豆制品的2 號(hào)帶型與來(lái)源于病例的5號(hào)帶型相差4 個(gè)條帶，相似度達(dá)80.0%，見(jiàn)圖2。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PFGE 圖

2.4.3 致瀉大腸埃希氏菌

（1）毒力基因及血清分型。5 株致瀉大腸埃希氏菌均攜帶astA 毒力基因，為腸聚集性大腸埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）。

（2）耐藥情況。受試的15 種抗生素中，5 株致瀉大腸埃希氏菌對(duì)頭孢他啶、氨芐舒、亞胺培南、頭孢西丁、頭孢噻肟、慶大霉素、阿奇霉素的敏感率為100%，對(duì)頭孢唑林和環(huán)丙沙星的敏感率為80%，對(duì)四環(huán)素和復(fù)方磺胺呈現(xiàn)不同程度的耐藥，見(jiàn)表5。

表5 致瀉大腸埃希氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品5 株致瀉大腸埃希氏菌分離菌株及同時(shí)期腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌分離菌株進(jìn)行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于62.5%～77.3%，來(lái)源于豆制品的菌株與同期病例菌株未見(jiàn)較近的親緣關(guān)系，見(jiàn)圖3。

圖3 致瀉大腸埃希氏菌PFGE 圖

3 討論

3.1 總體情況

此次檢測(cè)非發(fā)酵性即食豆制品共計(jì)70 份，合格率僅為38.57%，表明北京市通州區(qū)非發(fā)酵性即食豆制品衛(wèi)生質(zhì)量不容樂(lè)觀。這與呂秋艷等[14]在北京市門(mén)頭溝區(qū)非發(fā)酵豆制品微生物污染調(diào)查分析中的合格率25%相比較高，與劉曉娟[15]在邯鄲市非發(fā)酵豆制品微生物污染調(diào)查分析中的合格率39.16%結(jié)果相近。菌落總數(shù)合格率僅38.57%，說(shuō)明產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和售賣(mài)等環(huán)節(jié)均可能有微生物污染。并且檢出14 株致病菌，表明非發(fā)酵即食豆制品有引起食物中毒的潛在危險(xiǎn)。

3.2 散裝和預(yù)包裝

預(yù)包裝豆制品合格率為72.00%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于散裝豆制品的20.00%，與雷少華[16]的研究結(jié)果相一致。衛(wèi)生指標(biāo)菌（菌落總數(shù)和大腸菌群）散裝樣品合格率僅為20.00%，而預(yù)包裝產(chǎn)品合格率72.00%，提示散裝產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、售賣(mài)等各個(gè)環(huán)節(jié)中更容易受到微生物的污染。特別是檢出的14 株致病菌，有13 株來(lái)自散裝豆制品，致病菌檢出率為28.89%，說(shuō)明散裝即食非發(fā)酵豆制品存在很大的食品安全隱患。為了保障食品安全，應(yīng)該進(jìn)一步研究探討微生物污染的來(lái)源，采取相應(yīng)的控制措施，提高產(chǎn)品的衛(wèi)生合格率。也提示產(chǎn)品包裝是防止微生物污染的有效手段，為相關(guān)部門(mén)對(duì)豆制品的安全管理提供依據(jù)。

3.3 銷售場(chǎng)所

不同銷售場(chǎng)所菌落總數(shù)合格率分別為超市56.67%、網(wǎng)店40.00%、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)20.00%。超市的合格率最高，這可能是因?yàn)槌袑?duì)于產(chǎn)品質(zhì)量把控嚴(yán)格，進(jìn)貨渠道正規(guī)，儲(chǔ)存條件適宜；合格率最低的是農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，這可能與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)衛(wèi)生狀況較差，沒(méi)有良好的防塵、防蠅措施以及冷藏條件有關(guān)；網(wǎng)店是新興事物，還缺乏相關(guān)的管理規(guī)范，衛(wèi)生條件良莠不齊，總體合格率也不高。此外農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品致病菌檢出率最高，劉琴等[17]的研究表明沙門(mén)氏菌等致病菌的污染在一定程度上是由農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)較差的衛(wèi)生條件所致，提示衛(wèi)生管理部門(mén)應(yīng)對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)衛(wèi)生條件較差的小攤位加強(qiáng)監(jiān)督管理，堅(jiān)決取締不合格的經(jīng)營(yíng)攤點(diǎn)。此外應(yīng)盡快出臺(tái)對(duì)網(wǎng)店的監(jiān)管措施，做好食品安全工作，保證消費(fèi)者的身體健康。

3.4 致病菌情況

（1）沙門(mén)氏菌。在分離出的沙門(mén)氏菌中，有2 株鼠傷寒沙門(mén)氏菌，1 株腸炎沙門(mén)氏菌，調(diào)查顯示鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌是導(dǎo)致人群感染沙門(mén)氏菌病的主要血清型[18]，這些沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林等呈現(xiàn)不同程度耐藥性。在PFGE 聚類分析中，來(lái)源于市場(chǎng)的3 號(hào)豆制品PFGE 條帶與來(lái)源于病例的2、3、4、5 號(hào)條帶相似度為88.7%，表明為同一克隆群，因缺少病例流行病學(xué)資料未能成功溯源，但提示該豆制品可能為沙門(mén)氏菌感染性腹瀉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)食品。

（2）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。資料顯示，在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中，常見(jiàn)的能夠致病的血清型為1/2a、1/2b 和4b[19]。本研究中分離出的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中，3 株血清型為1/2a，1 株血清型為1/2b，是常見(jiàn)致病血清型。此外，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌致病性與毒力基因密切相關(guān)，prfA 是調(diào)控基因，缺失后會(huì)使單增菌毒力喪失[20]，plcB 產(chǎn)生磷脂酰膽堿磷脂酶促進(jìn)細(xì)菌在宿主間的擴(kuò)散[21]，inlA 是內(nèi)化素基因與細(xì)菌的侵襲力有關(guān)[22]，iap 產(chǎn)生p60 蛋白[23]，hiy 產(chǎn)生溶血素，plcA 基因編碼一個(gè)特異作用于磷脂酰肌的磷脂酶，它主要協(xié)同plcB 發(fā)揮作用[24]，本次檢測(cè)所有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌6 對(duì)毒力基因均為陽(yáng)性。在PFGE 聚類分析中，有病例菌株和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豆制品菌株條帶相似度達(dá)90%以上，說(shuō)明可能是同一克隆來(lái)源的菌株，且致病的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可能在本地區(qū)長(zhǎng)期存在，散裝即食豆制品是風(fēng)險(xiǎn)食品。

（3）致瀉大腸埃希氏菌。在分離的大腸埃希氏菌中，所有菌株均攜帶astA 毒力基因?yàn)镋AEC，與李梅基等[25]調(diào)查的優(yōu)勢(shì)菌株類型和毒力基因一致。在伊朗、巴西兒童腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌的研究中，EAEC 的檢出率居首位[26]。豆制品分離出的EAEC 對(duì)復(fù)方磺胺和四環(huán)素耐藥，這為今后臨床治療兒童腹瀉病例提供了方向。

4 結(jié)論

北京市通州區(qū)即食非發(fā)酵豆制品污染較為嚴(yán)重，將檢出的食源性致病菌和病例菌株進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)存在食品安全隱患；網(wǎng)店作為新興購(gòu)物渠道，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有即食非發(fā)酵豆制品網(wǎng)店樣本的相關(guān)報(bào)道，本研究做了初步的探索，發(fā)現(xiàn)與超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等常規(guī)采樣場(chǎng)所對(duì)比，樣品檢驗(yàn)合格率處于居中水平，但整體合格率較低。本次即食非發(fā)酵豆制品的采樣量比較小，分析還不夠透徹，且沒(méi)有分析季節(jié)變化對(duì)污染狀況的影響，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)完善相關(guān)研究數(shù)據(jù)。