楊志強,陳小婉,張小兵

(1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,甘肅 蘭州 730000)

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME),又稱滲出性中耳炎、卡他性中耳炎和膠耳等,是一類以中耳積液及聽力下降為主要特征的疾病。OME的平均發(fā)病率約14.7%,美國兒科學會和耳鼻咽喉學會等的數(shù)據(jù)表明在冬季等季節(jié)發(fā)病率甚至可達84%。OME的臨床表現(xiàn)以聽力逐漸下降為主要癥狀,常無耳痛及耳朵流膿等表現(xiàn),由于90%的患者年齡小于5歲,常由于未察覺癥狀且描述不清而延誤就診,病程延長后中耳腔滲液的黏稠度增加,更不易清除。中耳腔持續(xù)存在的滲液,會進一步導致黏連性中耳炎、鼓室硬化和膽固醇性肉芽腫等不良后果,造成永久性聽力下降,迄今仍無有效治療方法。OME 患兒平均引起28 dBHL的聽力損失,其中20%的患兒聽力損失大于35 dBHL,同時OME的好發(fā)年齡正是兒童語言形成及發(fā)展的關鍵時期,分泌性中耳炎患兒出現(xiàn)聽力下降,將會導致語言發(fā)育遲緩,從而影響其交流、閱讀和寫作能力[1-2]。30%～40%的OME患兒反復復發(fā),5%～10%的患兒病程達1年以上[1-2]。OME的發(fā)病主要與咽鼓管功能障礙、感染、免疫相關[3-4],但該疾病病理機制尚不明確,其治療方案也不統(tǒng)一[5]。因此,明確OME的病理機制,提高其診療水平,縮短病程,減小OME對兒童言語發(fā)育水平及交流能力的不利影響,對于防聾治聾工作有著重要的意義。

1996年,Takei等[6]發(fā)現(xiàn)中性粒細胞經(jīng)佛波酯處理后,中性粒細胞核染色質從破裂的核被膜和細胞膜中釋放而顯示出形態(tài)變化,該變化被認為是一種獨特類型的中性粒細胞死亡。Brinkmann等[7]對這種變化進行了深入研究,并發(fā)現(xiàn)釋放的核染色質能夠形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)絡(neutrophil extracellular traps,NETs),此后涉及NETs的研究明顯增加。NETs是一種能夠對抗毒性因子并殺滅細菌的胞外網(wǎng)狀結構,主要由解聚DNA的胞外鏈以及中性粒細胞顆粒蛋白組成,這些蛋白包括組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、組織蛋白酶G、白細胞蛋白酶3等30多種蛋白和酶組成[7-9]。有研究在OME患者中耳滲液中發(fā)現(xiàn)NETs的主要成分如組蛋白、NE等和較高濃度的中性粒細胞激活標志物:MPO和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白等[10-12],提示OME的炎性反應以NETs為主。

近年來研究發(fā)現(xiàn),NETs雖可以捕殺細菌、真菌、病毒和寄生蟲,并防止細菌和真菌播散并對抗嚴重感染,但NETs的過度形成會導致炎癥的惡化、自身免疫性疾病的發(fā)生、癌癥和血栓的形成等[13-16]。其中NETs清除耳部病原體的能力可能有助于在中耳積液中建立穩(wěn)定的生物膜群落,加之胞外DNA形成的網(wǎng)狀結構骨架,可能會阻礙中耳積液和相關細菌的清除,最終導致慢性OME的發(fā)展[17-18]。本綜述將討論NETs的形成及其在OME中作用的研究進展,強調NETs在OME中的雙向作用,為OME的病理機制提供新思路。

1 NETs的形成

NETs主要包括溶解性NETs和非溶解性NETs。中性粒細胞經(jīng)各種刺激誘導活化后,會引起細胞核DNA和/或線粒體DNA向胞外釋放[19-20],最終形成NETs的主體結構。

溶解性NETs的形成被認為是一種特殊類型的中性粒細胞程序性死亡,屬于固有免疫[14,21]。由于各種刺激,中性粒細胞內依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[22-23]。ROS聯(lián)合MPO并調節(jié)其表達[24-25],以促進NE釋放并轉移到細胞核內[22,24]。細胞核內的NE促進組蛋白的瓜氨酸化[26],導致染色質解離以及核DNA的釋放,最終導致核DNA的胞外釋放及NETs的形成[22,24,27]。此外,線粒體相關的ROS在某些刺激下也可誘導溶解性NETs的形成[28-29]。

非溶解性NETs的形成維持了中性粒細胞質膜的完整性,保證了中性粒細胞的存活及功能的完整性[30-31]。研究表明,非溶解性NETs依賴Toll樣受體和補體蛋白的參與[20,32]。其中粒細胞-巨噬細胞刺激因子能夠刺激中性粒細胞線粒體DNA釋放形成NETs,并且這類NETs的形成與ROS密切相關[20]。而金黃色葡萄球菌可以誘導中性粒細胞核DNA通過核膜起泡和囊泡輸出的形式形成NETs,這與ROS無明顯相關性[19]。然而,目前對非溶解性NETs的研究較少,這需要更多、更深入的研究來拓寬這一領域。

2 NETs在OME中的作用

中性粒細胞是炎癥反應的主要效應細胞之一,在炎癥初期起到了至關重要的防御作用。NETs作為中性粒細胞功能作用的新機制,依靠其獨有的三維網(wǎng)狀結構,對細菌、真菌、病毒以及寄生蟲等病原微生物的免疫作用提供了結構基礎,并在心血管疾病、自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和哮喘等疾病中發(fā)揮著重要作用[14,33]。另一方面,NETs獨特的網(wǎng)狀結構也阻礙了病原體的清除,促使疾病轉化為慢性病狀態(tài)[17-18]。大量研究證明,NETs在OME患者的中耳積液中廣泛存在,并且發(fā)揮著雙向作用。

2.1 OME中的NETs

OME患者或者動物模型中耳黏膜或中耳積液中存在NETs,其主要成分以及特有的網(wǎng)狀結構提示OME炎性反應中NETs起到了重要作用。OME患者中耳積液廣泛存在NETs結構[10,12,17,34]。流感嗜血桿菌[18]及其裂解物[35]、肺炎雙球菌[36]能夠建立OME動物模型,并且在誘導的動物模型中耳黏膜及中耳積液中發(fā)現(xiàn)了NETs主要蛋白成分組蛋白、NE、MPO以及廣泛的胞外DNA網(wǎng)狀纏繞,說明NETs參與OME的炎性反應。除了建立動物模型,有研究還進行了細胞實驗驗證,發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌裂解物[35]、肺炎雙球菌[36]和牛分支桿菌[37]能夠誘導中性粒細胞形成獨特的網(wǎng)格結構,并檢測到NETs相關蛋白,這與佛波酯(一種廣泛激活NETs形成的刺激物[36])誘導的形成NETs一致。

2.2 OME中NETs相關蛋白及信號通路

NE、MPO、組蛋白在內的30余種蛋白參與構成NETs的形成[7-9]。而在OME中,研究表明,組蛋白、乳鐵蛋白酶、NE、MPO、黏蛋白5B(mucin 5B,MUC5B)和MUC5AC等蛋白與NETs的形成密切相關[10,17-18,34,36,38]。其中MUC5B、MUC5AC作為氣道分泌蛋白,主要由氣道杯狀細胞和黏膜下腺體合成,形成上呼吸道的黏液,對黏液的黏彈性起決定作用,進一步影響?zhàn)ひ豪w毛清除的功能,并且能夠在中耳黏膜中分泌[35,39- 40]。已有研究發(fā)現(xiàn),OME患者的中耳滲液中存在大量的黏蛋白MUC5AC和MUC5B[35],以MUC5B為主[12,41]。病原體的刺激能夠激活NF-κB通路,促進趨化因子CxCl2表達,從而間接調控黏蛋白基因的表達[35]。而MUC5B的表達與OME患者聽力損失明顯相關[41]。在OME患者中耳積液中,MUC5B與胞外DNA組成了網(wǎng)狀結構[12],此外MUC5B能夠在體外強力誘導NETs的形成[34],這提示MUC5B與NETs的形成具有明顯相關性。而白介素-8能夠趨化并活化中性粒細胞,在中耳積液中的細胞因子具有極高的豐度[12],但其誘導NETs形成的能力較MUC5B弱[34]。也有研究分析了不同病程組OME患者細胞因子的表達量,發(fā)現(xiàn)3個月以上OME兒童中耳積液白介素-8的平均濃度是3個月以下OME患者的10.9倍,這說明白介素-8可能促進了OME轉化為慢性病狀態(tài)[42]。

自噬和ROS的形成對OME相關NETs的形成是不可或缺的,Dong等[36]使用自噬抑制劑和ROS抑制劑分別處理了OME動物和細胞模型,發(fā)現(xiàn)NETs減少,并且ROS抑制劑能夠逆轉自噬的激活。此外,缺乏Toll樣受體4的中性粒細胞相對于正常中性粒細胞ROS表達量降低、自噬活性下降及NETs減少,表明在急性OME過程中,NETs是中性粒細胞對抗肺炎雙球菌的重要抗菌物質,其中Toll樣受體4通過調控自噬激活和ROS的產(chǎn)生參與調節(jié)了NETs的形成[36]?？贵w一般由B淋巴細胞分泌,并與抗原結合形成抗原-抗體復合物而被機體清除。Short等[43]檢測了正常小鼠、缺乏B細胞抗體小鼠和缺乏聚合性免疫球蛋白受體(導致血清游離IgA、IgG增多)小鼠的OME模型中NETs的表達,以及小鼠中耳細菌的滴度,發(fā)現(xiàn)抗體促進了NETs的形成,并導致了細菌在中耳的生長,這可能是OME慢性持續(xù)的原因之一。

2.3 NETs參與OME細菌生物膜的形成

研究發(fā)現(xiàn),NETs對細菌生物膜的形成具有顯著作用,這會促使疾病轉化為慢性病狀態(tài)。在OME的龍貓模型中, NETs存在于流感嗜血桿菌為主的細菌生物膜中,由于流感嗜血桿菌表面的寡聚糖會抵抗NETs對細菌的清除,NETs特有的網(wǎng)狀結構反而有助于生物膜的形成,并最終導致了細菌在體內的持久性[18]。Tornton等[17]的研究評估了36份中耳積液樣本,發(fā)現(xiàn)33份樣本存在廣泛由NE與胞外DNA共同纏繞形成的NETs,并且NETs中DNA和細菌均與凝集素相聯(lián)系,而凝集素與生物膜基質中的糖蛋白結合,提示DNA參與構成了中耳積液中的多菌生物膜,NETs清除耳部病原體的能力可能有助于在中耳積液中建立穩(wěn)定的生物膜群落。在急性中耳炎的動物顳骨和急性起病和復發(fā)中耳炎捐贈者的顳骨中,細菌被包裹在纖維蛋白網(wǎng)絡的NETs中,以遏制和消除細菌,但它也可能保護這些微生物不被炎癥細胞和抗生素清除,從而提供細菌聚集和生物被膜生長的環(huán)境,并增加再次感染和疾病慢性化的風險[10]。

2.4 OME中NETs的降解

NETs由胞外DNA作為網(wǎng)狀結構骨架,上面有各種顆粒蛋白鑲嵌、纏繞和包繞而形成的三維結構[7]。DNA作為結構主體的破壞能夠促進NETs的降解,從而促進炎癥前期病原體對NETs清除的抵抗[37, 44]或是改善慢性炎癥中病原體在中耳的清除[17, 43]。牛分枝桿菌能誘導中性粒細胞形成NETs,與此同時,其分泌的核酸酶MnuA能夠迅速酶解NETs的胞外DNA鏈,引起NETs的降解,并抵抗NETs對牛分枝桿菌的清除[36-37]。DNA酶干預肺炎雙球菌導致的OME小鼠模型后,小鼠中耳細菌滴度明顯下降[43]。而在DNA酶處理后的中耳積液中,NETs的胞外DNA結構及細菌生物膜基質的降解,導致細菌暴露于機體的免疫系統(tǒng)并被清除[17]。因此,局部使用DNA酶結合抗生素,不失為慢性及復發(fā)性OME患者的一種新的治療方案。

3 總結與展望

OME是常見引起聽力下降的疾病,感染在其疾病進程中發(fā)揮著重要作用。目前NETs在OME中的研究較少,但已經(jīng)逐漸成為國內外研究的重點。一方面,中性粒細胞釋放的NETs能夠清除病原體,對抗感染;另外一方面NETs獨特的網(wǎng)狀結構可能保護病原體對抗免疫系統(tǒng)和抗生素的清除,并且有些病原體能生成對抗NETs的分泌物,這進一步導致了疾病的遷延不愈。

NETs參與了多種疾病過程,作為新的治療靶點,NETs抑制劑對疾病的治療已經(jīng)取得了一定的進展:當使用DNA酶處理細胞后,NETs的網(wǎng)狀結構出現(xiàn)降解; DNA酶已經(jīng)被批準用于囊性纖維化和膿胸的治療[45];中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑西維來司鈉通過減少NETs的合成,具有保護上皮細胞的作用,被用于肺損傷等疾病的治療[46]。在OME動物模型身上,給予DNA酶鼓室注射后,觀察到了鼓室積液減少[17]。目前,關于NETs對抗并清除中耳炎病原體的作用機制仍有很大的研究空間。因此,如果能夠明確感染和NETs在OME中的病理機制,平衡NETs的雙向作用,將為OME的治療提供新的方向,尤其是對病程較長、滲液黏稠的患者具有更重要的意義。