劉 鑫,胡福境,蘇 穎,曾毅飛,潘芳蓮,覃桂聰
(廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西 南寧 530199)
RNA 結(jié)合蛋白(RBP) 具有高度動態(tài)的時空調(diào)控作用和重要的生物學功能,它們通過轉(zhuǎn)錄后控制RNA 的加工和運輸,包括調(diào)節(jié)RNA 剪接、聚腺苷酸化、mRNA 穩(wěn)定性、mRNA 定位和翻譯,對維持轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定至關(guān)重要[1]。人類RBPs 約有2000 種,占蛋白質(zhì)編碼基因的7.5%。越來越多的研究表明,RBPs 介導(dǎo)的RNA 修飾在癌癥進展中具有重要作用,它們可在不同類型的癌癥中異常表達,同時可調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達和功能[2]。La 相關(guān)蛋白1 (LARP1) 是一種進化保守的RNA 結(jié)合蛋白,屬于LARP 超家族的一員。它在果蠅體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn),被證明可與聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PABP) 結(jié)合,是胚胎發(fā)育和生育所必需的RNA 結(jié)合蛋白。研究表明,LARP1 是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 通路與TOP mRNA 調(diào)控之間的重要的鏈接蛋白,是mTORC1 的底物,通過它的多個結(jié)構(gòu)域如LaM、RRM-L、PABP 結(jié)合域、DM15 域的mRNA 結(jié)合,既可以調(diào)節(jié)以5′末端寡核苷酸( 5′TOP)基序為特征的mRNA 的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)譯,也可與某些5′TOP mRNA 的3′ 端多聚A 尾結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA 的功能[3]。在宮頸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多種癌癥中,LARP1 的高表達與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系密切[4-6]。雖然研究表明LARP1 在多種腫瘤中均有促癌的作用,但目前仍缺乏它在泛癌中作用及相關(guān)機制的分析。因此,本研究運用多種數(shù)據(jù)庫對LARP1 的功能進行了系統(tǒng)分析,利用多組學數(shù)據(jù)證明LARP1 是影響患者腫瘤發(fā)生和臨床預(yù)后的關(guān)鍵分子,也是泛癌微環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)控因子。
TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)是一個分析各種癌癥中免疫細胞浸潤的在線資源數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫采用反卷積方法作為統(tǒng)計方法,可從基因表達譜中推斷腫瘤組織中免疫細胞的浸潤豐度。本研究主要是應(yīng)用Cancer Exploration 模塊中的 Gene_DE 模塊分析LARP1 在33 種TCGA 數(shù)據(jù)庫腫瘤組織中的表達。
應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)分析LARP1 在乳腺癌 (BRCA)、卵巢癌 (OV)、結(jié)腸癌(COAD)、腎透明細胞癌(KIRC)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)和肺腺癌 (LUAD)組織中的表達情況及甲基化情況。
應(yīng)用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)分析LARP1 在腫瘤中的改變情況。
應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的腫瘤數(shù)據(jù)進行分析,應(yīng)用多重假設(shè)檢驗(Dunn’s test) 法分析LARP1 在不同腫瘤分期中的意義。
根據(jù)Kaplan-Meier 曲線分析29 種癌癥中LARP1表達與患者預(yù)后〔包括總生存期(OS)、疾病特異性生存期(DSS)〕之間的關(guān)系。應(yīng)用單因素生存分析法計算危險比(HRs) 和95% 置信區(qū)間。
采用TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù),應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)GSVA 包(1.34.0 版本)(H?nzelmann et al, 2013) 中的ssGSEA 分析各種腫瘤中LARP1 與24 種免疫細胞浸潤的相關(guān)性,結(jié)果以熱圖顯示。
采用SangerBox 數(shù)據(jù)庫,對LARP1 蛋白表達水平與免疫檢查點基因表達水平的相關(guān)性進行分析。在UCSC(https://xenabrowser.net/) 數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標準化的泛癌數(shù)據(jù)集:TCGA TARGET GTEx(PANCAN,N=19131,G=60499), 進一步從中提取LARP1 基因和60 個兩類免疫檢查點途徑基因Inhibitory(24)、Stimulatory(36),對每一個表達值進行l(wèi)og2(x+0.001) 變換,計算LARP1 與免疫途徑標記基因的pearson 相關(guān)性。
采用R 軟件包(3.6.3 版本)進行統(tǒng)計學分析。采用Mann-Whitney U 檢驗法分析LARP1 mRNA 在泛癌中的表達情況,將Survival 包(3.2-10 版本)用于生存治療分析,采用Bonferroni 法校正的顯著性水平多重假設(shè)檢驗(Dunn’s test) 法分析LARP1 與病理分期的相關(guān)性,將GSVA 包(1.34.0 版本) 用于免疫浸潤關(guān)聯(lián)性分析。
TIMER 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,相較于正常組織,LARP1 在 BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC、KICH、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD中的表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在GBM、KIRP、THCA 中的表達明顯減低(P<0.05)。見圖1。
利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫 CPTAC 模塊分析 9 種癌組織中LARP1 蛋白的表達水平。與癌旁正常組織比較,LIHC、OV、COAD、BRCA、KIRC、LUAD 、UCEC組織中 LARP1 蛋白的表達水平明顯升高 (P<0.01),GBM 和PAAD 組織中LARP1 蛋白的表達水平明顯降低(P<0.01)( 見圖2)。DNA 甲基化分析也發(fā)現(xiàn),在 BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等腫瘤組織中LARP1 DNA 甲基化水平顯著降低(見圖3)。
圖2 CPTAC 數(shù)據(jù)庫分析LARP1 蛋白在腫瘤和正常組織中的表達水平
圖3 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析LARP1 蛋白在腫瘤中LARP1 啟動子甲基化的水平
使用cBioPortal (TCGA, pan-cancer Atlas)數(shù)據(jù)庫研究LARP1 基因在泛癌中改變情況的結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜癌LARP1 基因突變率最高,達7.51% ;幾乎所有的腫瘤中都存在LARP1 基因突變的情況(見圖4a),LARP1 基因突變明顯影響腫瘤患者的總體生存率(見圖4b)。
圖4a LARP1 基因在泛癌中的改變情況
圖4b LARP1 基因改變對腫瘤患者總體生存率的影響
應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的不同病理分期(Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的腫瘤數(shù)據(jù)進行分析,觀察LARP1 與腫瘤分期的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARP1 表達升高與LIHC、LUAD、SKCM、LUSC、ACC、STAD、THCA 病理分期明顯相關(guān)(見圖5)。
圖5 LARP1 與腫瘤病理分期的關(guān)系
生存分析結(jié)果顯示,LARP1 與ACC、BRCA、CESC、HNSC、KIRC、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM 患者的總生存期明顯相關(guān);其中LARP1 的高表達與ACC、BRCA、CESC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM、HNSC 預(yù)后差明顯相關(guān)(見圖6a)。疾病特異性生存期(DSS)方面的結(jié)果顯示LARP1的表達情況影響了ACC、BRCA、CESC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UVM 13 種腫瘤的DSS(見圖6b)。
圖6a LARP1 表達與腫瘤OS 的關(guān)系
圖6b LARP1 表達與腫瘤DSS 的關(guān)系
R 語言分析結(jié)果顯示,LARP1 的表達水平與ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD 等19 種腫瘤組織中免疫細胞(活化的樹突狀細胞、B 細胞、CD8+T淋巴細胞、細胞毒性細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、免疫性樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、NK 細胞亞群CD56bright、NK 細胞亞群CD56dim、NK 細胞、漿細胞樣DC 細胞、T 淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞、中央記憶性T 淋巴細胞、濾泡輔助性T 淋巴細胞、γδT 細胞、Th1 細胞、Th17 細胞、Th2 細胞和調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞)的表達水平有明顯的相關(guān)性(0 <r<1,P<0.01)。其中與輔助性T 淋巴細胞、中央記憶性T 淋巴細胞、Th2 細胞在大多數(shù)腫瘤中呈正相關(guān)(見圖7)。
圖7 各種腫瘤中LARP1 表達與免疫細胞浸潤的相關(guān)性
采用SangerBox 數(shù)據(jù)庫,對LARP1 蛋白表達水平與免疫檢查點基因表達水平的相關(guān)性進行分析,結(jié)果如圖8 所示。LARP1 在眾多腫瘤中與刺激性和抑制性免疫檢查點的表達均有顯著的相關(guān)性。
圖8 LARP1 蛋白表達水平與免疫檢查點基因表達水平的相關(guān)性
目前,腫瘤仍然是威脅人類健康的主要疾病之一,世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名前三的腫瘤是乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌[7]。針對惡性腫瘤的治療方式主要有手術(shù)、化療、放療以及基于檢查點的免疫療法、分子靶向治療,早期發(fā)現(xiàn)和有效治療是改善癌癥患者預(yù)后的重要前提。腫瘤患者個體化的精準治療是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵,其中分子靶向藥物治療療效顯著,副作用小,但藥效的個體差異較大。免疫檢查點蛋白(ICP) 的鑒定是免疫學中最熱門的研究課題之一。ICP 能夠以環(huán)境依賴性的方式調(diào)節(jié)多種免疫功能。針對癌癥患者的ICP 治療,常用的藥物是ICP 的抑制劑,它可以阻斷免疫檢查點對腫瘤細胞的保護作用,克服傳統(tǒng)癌癥治療的局限性,相關(guān)實驗中已經(jīng)取得了較好的效果,有數(shù)種藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床[8]。因此,單基因的泛癌生物信息學分析有助于研究不同癌癥之間的異同,研究其與免疫細胞及免疫檢查點的關(guān)系,可為癌癥預(yù)防和個性化靶向治療及免疫治療策略的設(shè)計提供依據(jù)。
通過分析,我們發(fā)現(xiàn)RNA 結(jié)合蛋白LARP1 在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC 等多種腫瘤與正常組織中存在明顯的表達差異,且與腫瘤的分期和預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。目前國內(nèi)的多個研究已證實LARP1 的表達與卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及膽囊癌的預(yù)后明顯相關(guān),隨著研究的深入,LARP1 有望成為評估特定腫瘤患者預(yù)后的一個潛在的重要標志物。
DNA 甲基化是一種在表觀遺傳基因表達調(diào)控、基因組印記、X 染色體失活、轉(zhuǎn)座子沉默和基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用的化學修飾過程,異常DNA甲基化模式是腫瘤細胞的特點之一;基因啟動子的DNA 高甲基化使基因轉(zhuǎn)錄受抑,常導(dǎo)致癌細胞中抑癌基因的沉默或失活[9]。分析發(fā)現(xiàn)在BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等腫瘤組織中,LARP1 DNA甲基化水平顯著降低,同時這些腫瘤中的LARP1 呈高表達,故DNA 甲基化與LARP1 表達的關(guān)系值得進一步研究。除此之外,在眾多腫瘤中都存在LARP1基因突變、擴增和深度缺失等情況,LARP1 基因的這些改變似乎能改善腫瘤的總體死亡率,LARP1 基因改變對不同類型腫瘤的影響有待深入研究。
腫瘤微環(huán)境(TME)包括腫瘤中的所有非癌性宿主細胞,包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元、脂肪細胞、適應(yīng)性和先天免疫細胞(如T 淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等),以及其非細胞成分,包括細胞外基質(zhì)(ECM) 和可溶性產(chǎn)物,如趨化因子、細胞因子、生長因子和細胞外囊泡。TME 在癌癥特征的獲得和維持中發(fā)揮著重要作用,如維持增殖信號、抵抗細胞死亡、誘導(dǎo)血管生成、激活侵襲和轉(zhuǎn)移、引發(fā)腫瘤促炎、避免免疫破壞[10]。針對TME 中成分的治療,是腫瘤治療的一個新方向,例如靶向成纖維細胞表面FAPα特異性抗原的西羅株單抗和在研多種針對腫瘤相關(guān)巨噬細胞的藥物均已取得可喜的臨床和實驗結(jié)果[11]。我們通過分析發(fā)現(xiàn),LARP1 在腫瘤中與樹突狀細胞、輔助性T 淋巴細胞、NK 細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞存在相關(guān)性,其中與輔助性T 淋巴細胞、中央記憶性T 淋巴細胞、Th2 細胞在大多數(shù)腫瘤中呈正相關(guān)。我們分析各種腫瘤中LARP1 與免疫檢查點的關(guān)系發(fā)現(xiàn),在大多數(shù)腫瘤中,LARP1 與刺激性和抑制性免疫均呈正相關(guān),這顯示了腫瘤免疫環(huán)境的復(fù)雜性,說明LARP1 參與了腫瘤生存、發(fā)展的免疫調(diào)控作用,對其具體機制的研究具有重要意義。
通過泛癌分析發(fā)現(xiàn),LARP1 在多種腫瘤中異常表達,與多種腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān);與多種癌癥中活化的樹突狀細胞、B 細胞、CD8+T 淋巴細胞、細胞毒性細胞、嗜酸性粒細胞、免疫性樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞等免疫細胞的浸潤相關(guān)。在多種癌癥中,均可觀察到LARP1 甲基化減少,LARP1 的表達與免疫檢查點標記物的表達顯著相關(guān)。進一步研究LARP1 在癌癥中的分子機制對癌癥的診治具有非常重要的意義。