周連妹 李智深 黃敏如

(廣東省儲(chǔ)備糧管理集團(tuán)有限公司韶關(guān)直屬庫(kù) 512000)

目前，嘔吐毒素檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法等[10]，其中高效液相色譜法雖可精確定量，但樣品前處理較繁瑣，對(duì)操作人員的素質(zhì)要求較高，且儀器昂貴，檢測(cè)成本較高，適合大型企業(yè)、科研院校、檢測(cè)機(jī)構(gòu)或?qū)z測(cè)靈敏度要求較高的單位零散使用，不適合基層糧庫(kù)應(yīng)用于大批量收糧現(xiàn)場(chǎng)。相比之下，便捷、靈敏、低成本及適合大批量樣品篩選的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ElISA)越來越受到關(guān)注[11-12]。本文以膠體金快速定量法檢測(cè)玉米嘔吐毒素為例，通過實(shí)驗(yàn)分析總結(jié)了影響檢測(cè)結(jié)果的因素，以期為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2021年產(chǎn)自吉林和黑龍江的普通黃玉米。

1.2 主要設(shè)備和試劑

主要設(shè)備及試劑如表1。

表1 主要設(shè)備及試劑

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 樣品按以下5種前處理方式分別進(jìn)行制備。

(1)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出4份，每份約500 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用。

(2)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出4份，每份約100 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用。

(3)將2 kg玉米去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，充分混勻后用四分法分出4份，每份約500 g，混勻備用。

(4)將2 kg玉米去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，充分混勻后用四分法分出4份，每份約100 g，混勻備用。

(5)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出2份，每份約500 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm和2.0 mm孔徑的篩子，混勻備用。

1.3.2 測(cè)定步驟

(1)準(zhǔn)確稱量5.0 g粉碎樣品于50 mL離心管，加入25 mL去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min。

(2)取1000 μL上清液于1號(hào)離心管中，放入離心機(jī)5000 r/min，離心1 min。

(3)從1號(hào)離心管中取100 μL樣品提取液放入2號(hào)離心管，加入1000 μL稀釋緩沖液(DONQ)，渦旋振蕩10 s。

(4)將嘔吐毒素快檢試劑條放入孵育器中，膠紙撕開至黑線處，取300 μL待測(cè)稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中后蓋上膠紙，45℃孵育5 min。

(5)讀數(shù)儀調(diào)至DON-00檔，讀數(shù)。

(6)當(dāng)數(shù)值顯示1501+時(shí)，需二次稀釋：從2號(hào)離心管取300 μL溶液放入3號(hào)離心管，加入1000 μL稀釋緩沖液(DONQ)，渦旋振蕩10 s。再重復(fù)上述步驟(4)。

(7)讀數(shù)儀調(diào)至DON-01檔，讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控樣品檢測(cè)

按照產(chǎn)品說明要求，分別檢測(cè)檢測(cè)條自帶的陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控樣品，結(jié)果如表2。

表2 質(zhì)控樣品檢測(cè)情況表

由表2可知，陽(yáng)性質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果均在500 μg/kg～1500 μg/kg范圍內(nèi)，陰性質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果均小于100 μg/kg，說明本檢測(cè)試條質(zhì)量合格。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)設(shè)備操作步驟說明，將一個(gè)1040 μg/kg實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，結(jié)果如表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)情況表

由表3可知，實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品嘔吐毒素檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差未超出10%，說明該方法重復(fù)性較好。

2.3 粉碎樣品量和樣品縮分方式

取DON未超標(biāo)的玉米(樣品1-1和樣品1-2)和超標(biāo)的玉米(樣品2-1和樣品2-2)各一份，分別按樣品前處理(1)和(2)方式制得待測(cè)樣品，檢測(cè)結(jié)果見表4-1。

表4-1 先縮分后粉碎檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

分別取DON未超標(biāo)的玉米(樣品1-3和樣品1-4)和超標(biāo)的玉米(樣品2-3和樣品2-4)各一份，分別按樣品前處理(3)和(4)方式制得待測(cè)樣品，檢測(cè)結(jié)果見表4-2。

表4-2 先粉碎后縮分檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

從表4-1和表4-2可知：粉碎樣品量和樣品縮分方式均對(duì)樣品DON檢測(cè)數(shù)值的離散度有影響，且毒素超標(biāo)樣品的檢測(cè)值離散度變化更為顯著。同一DON含量水平的玉米樣品，其檢測(cè)值的變異系數(shù)隨粉碎樣品量減少而增大。從表4-1來看，粉碎樣品量從500 g降到100 g時(shí)，DON含量未超標(biāo)樣品的檢測(cè)值，變異系數(shù)增加了6.2個(gè)百分點(diǎn)；DON含量超標(biāo)樣品的檢測(cè)值，變異系數(shù)增加了16.1個(gè)百分點(diǎn)。且粉碎樣品量為100 g時(shí)，同一份原始樣品分出的四份次級(jí)樣品的檢測(cè)值已超出該方法的重復(fù)性要求[13]。從表4-2來看，同一粉末狀樣品，即先粉碎混勻后縮分，檢測(cè)值離散程度最小，但較高含量樣品的變異系數(shù)仍比低含量樣品的大。

分析可能有以下原因：一是讀數(shù)儀本身在不同數(shù)值范圍的精密度不同導(dǎo)致。讀數(shù)儀在數(shù)值未超過1000 μg/kg時(shí)，采用50進(jìn)制，數(shù)值超過1000 μg/kg時(shí)，采用100進(jìn)制。二是樣品本身毒素含量分布不均勻?qū)е?。先粉碎后縮分一方面是樣品粉碎量增加了，另一方面經(jīng)研磨粉碎后樣品粒徑大大降低，在此基礎(chǔ)上充分混勻有助于被測(cè)組分的均勻分布。玉米籽粒中水分等營(yíng)養(yǎng)成分較高，在生長(zhǎng)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)等環(huán)節(jié)易受真菌感染，在光照、溫度、水分活度等環(huán)境條件適宜時(shí)，產(chǎn)毒霉菌會(huì)生長(zhǎng)代謝出真菌毒素，產(chǎn)生的真菌毒素在玉米籽粒間的分布具有隨機(jī)性、不均勻的特點(diǎn)[14]。有些糧堆中受產(chǎn)毒霉菌污染的糧食顆粒很少，而被污染的籽粒中毒素含量極高[15]，在樣品量較少時(shí)，玉米顆粒較大的特點(diǎn)使樣品不均勻性進(jìn)一步凸顯。三是試樣量較少(5.0 g)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。試樣量越少檢測(cè)結(jié)果誤差越大，研究證明適當(dāng)增加試樣量可縮小雙試驗(yàn)誤差[16]。

綜上所述，檢測(cè)玉米嘔吐毒素時(shí)，制樣環(huán)節(jié)非常關(guān)鍵。特別是處理毒素含量較高的樣品時(shí)，簡(jiǎn)單地縮分出少量樣品進(jìn)行粉碎，極有可能出現(xiàn)同一樣品檢測(cè)值超出允許偏差范圍的情況。因此，需特別注意制備樣品的均勻性和代表性，適當(dāng)增加粉碎樣品量和試樣量。在確保準(zhǔn)確的同時(shí)兼顧考慮經(jīng)濟(jì)和效率，應(yīng)在充分混勻的原始樣品中縮分出不少于500 g進(jìn)行粉碎，且粉碎后的待測(cè)樣品要充分混勻再稱取足量試樣檢測(cè)。處理臨界值樣品時(shí)，在充分混勻原始樣品基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加粉碎樣品量，并結(jié)合多次獨(dú)立檢測(cè)取平均值的方式確定。

2.4 樣品細(xì)度影響分析

取9個(gè)玉米樣品，按樣品前處理(5)方式制得待測(cè)樣品，檢測(cè)結(jié)果見表5。

表5 樣品細(xì)度檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比表

由表5可知：經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)方差分析，T=2.395>T0.05，8=2.31，表明兩種樣品細(xì)度的檢測(cè)值之間存在顯著性差異，說明樣品粗細(xì)對(duì)DON檢測(cè)值有顯著影響。無論樣品DON含量高低，樣品粉碎顆粒大的檢測(cè)值均比粉碎顆粒小的低。且樣品DON含量越高，相差值越大。原因可能是樣品粒徑大的樣品表面積小，同等提取條件下大樣樣品中的DON提取不充分，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。

2.5 與高效液相色譜法一致性

取6個(gè)樣品，分別充分混勻后用四分法各分成兩份，其中一份委托廣東省質(zhì)量監(jiān)督糧油檢驗(yàn)站用免疫親和層析凈化高效液相色譜法檢測(cè)，另一份用膠體金快速定量法檢測(cè)。樣品充分混勻后分出500 g，去除雜質(zhì)后粉碎至完全通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用，檢測(cè)時(shí)室溫控制在20℃～25℃。檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 快速法與高效液相色譜法檢測(cè)玉米樣品結(jié)果對(duì)比

從表6可知：通過配對(duì)T檢驗(yàn)方差分析，Tmax=2.086

2.6 與高效液相色譜法相關(guān)性

以HPLC檢測(cè)值為橫坐標(biāo)，快速法檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，通過一般線性模型擬合，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)值具有一定相關(guān)性，如圖1所示。當(dāng)樣品DON含量(<1500 μg/kg)較低時(shí)，兩種方法檢測(cè)值具有良好的線性關(guān)系。如圖2所示，從線性回歸方程：Y=0.9058X+5.3762可知，膠體金快速定量法測(cè)得值普遍比HPLC測(cè)得值高，且含量越高，相差越大。這與朱云等[17]的研究結(jié)論一致。

圖1 兩種方法檢測(cè)值的線性擬合

圖2 低濃度嘔吐毒素兩個(gè)方法檢測(cè)值的線性擬合

3 結(jié)論

3.1 膠體金快速定量法檢測(cè)玉米嘔吐毒素樣品前處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，重復(fù)性較好。在檢測(cè)DON含量小于1500 μg/kg時(shí)，與高效液相色譜法具有良好的線性相關(guān)性，適合基層糧庫(kù)應(yīng)用于大批量樣品的篩查；在檢測(cè)高濃度樣品時(shí)，準(zhǔn)確度與高效液相色譜法相比還存在一定差距。

3.2 制樣環(huán)節(jié)對(duì)DON含量的準(zhǔn)確分析尤為關(guān)鍵，應(yīng)特別注意樣品代表性和均勻性，粉碎樣品量應(yīng)不少于500 g；處理臨界值樣品時(shí)，在充分混勻原始樣品基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加粉碎樣品量，并結(jié)合多次獨(dú)立檢測(cè)取平均值的方式確定。

3.3 樣品粉碎顆粒細(xì)度對(duì)檢測(cè)值影響顯著，粉碎粒徑應(yīng)能全部通過0.9 mm孔徑的篩子。而在原有提取條件下增大粒徑可能會(huì)使樣品中DON提取不充分，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

4 討論

由于玉米DON含量高低取決于是否感染相應(yīng)的產(chǎn)毒霉菌，而通過外觀觀察生霉粒和霉變粒多少無法準(zhǔn)確判斷DON含量，只能通過專業(yè)設(shè)備的檢測(cè)得知[18-19]，而檢測(cè)分析的每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能影響檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)總結(jié)實(shí)驗(yàn)室制樣環(huán)節(jié)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，同一份原始樣品充分混勻后縮分得出多份小樣粉碎，檢測(cè)值的變異系數(shù)仍有不同的差異。進(jìn)一步思考，DON在玉米等糧食中分布不均勻的特點(diǎn)在扦樣環(huán)節(jié)同樣需要特別注意。扦樣是檢測(cè)分析的第一步，樣品扦樣是真菌毒素檢測(cè)分析過程中最主要的變異或誤差來源，是準(zhǔn)確分析的決定因素[20]。扦樣點(diǎn)、扦樣量對(duì)真菌毒素檢測(cè)結(jié)果影響較大[21]。如果扦樣操作不規(guī)范或比較隨意，導(dǎo)致樣品代表性失真，再準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果對(duì)于被扦樣品來說也將毫無意義。隨著檢測(cè)分析中新技術(shù)和新方法的應(yīng)用，檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度不斷提高，而扦樣環(huán)節(jié)卻沒有引起足夠重視。因此，為更好保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，保障糧食安全，筆者認(rèn)為需進(jìn)一步針對(duì)DON等真菌毒素分析檢測(cè)制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)化扦樣操作規(guī)范，并加強(qiáng)相關(guān)人員技能培訓(xùn)，確保扦樣代表性。

由于檢測(cè)過程涉及的提取液體積較小，在規(guī)范操作移液槍的前提下，應(yīng)考慮檢驗(yàn)室環(huán)境溫度變化對(duì)溶液體積的影響，而相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)僅要求稀釋緩沖液從冷藏取出放置室溫后再使用[13]。根據(jù)工作經(jīng)驗(yàn)，不同室溫對(duì)檢測(cè)結(jié)果有不同程度的影響，因此建議進(jìn)一步研究討論明確室溫嚴(yán)格控制在20℃～25℃，有助于保障檢測(cè)準(zhǔn)確性。