韓 穎,李秀麗,豆子航,郭笑然,雷白時(shí),袁萬哲,2*,趙 款,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)創(chuàng)新中心 ,河北 保定 071001)

在養(yǎng)殖業(yè)中,抗生素被濫用,導(dǎo)致動物源性食品以及地表生態(tài)受到嚴(yán)重的污染[1-2],因此急需一些新的綠色環(huán)保藥物,使動物源性食品維持綠色健康水平。目前,中國羊養(yǎng)殖行業(yè)在逐漸向規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)殖模式發(fā)展,多種疾病需要進(jìn)行防治[3]。

干擾素(IFN)作為一種具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤功能且無殘留、無毒性、無副作用的新型生物制品,在1957年被英國科學(xué)家發(fā)現(xiàn),隨后被廣泛研究和應(yīng)用[4-5]。根據(jù)IFN識別受體的不同分為3種類型:Ⅰ型IFN、Ⅱ型IFN、Ⅲ型IFN;根據(jù)種屬不同分為不同的亞型,例如:已知人IFN-α有23個(gè)以上的亞型,分別以IFN-α1、IFN-α2等表示[6]。綿羊IFN分為3型,目前研究最多的為OviIFN-α、OviIFN-τ和OviIFN-γ以及OviIFN-λ。OviIFN-α和OviIFN-τ屬于Ⅰ型IFN;OviIFN-γ屬于Ⅱ型IFN;OviIFN-λ屬于Ⅲ型IFN[7]。IFN的抗病毒功能不是由IFN直接作用于病毒,是IFN與細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合引起的IFN級聯(lián)反應(yīng)所轉(zhuǎn)錄的ISGs發(fā)揮抗病毒作用[8]。以Ⅰ型IFN為例,胞外IFN與細(xì)胞表面具有高親和力的IFN受體(IFNAR1)結(jié)合,然后與低親和力IFN受體(IFNAR2)形成受體二聚體,受體構(gòu)象發(fā)生改變,形成有活性的三元復(fù)合物,引起與受體相關(guān)的JAK激酶招募與活化。被激活的JAK激酶催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化,使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子發(fā)生磷酸化。被磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(STAT1、STAT2)脫離受體,在胞漿中形成二聚體,與IFN調(diào)節(jié)因子9(IRF9)結(jié)合,形成激活的異源三聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(ISGF3),轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與IFN刺激基因上游啟動子區(qū)域的IFN刺激基因反應(yīng)元件結(jié)合(ISRE)刺激ISGs的轉(zhuǎn)錄,起到抗病毒功能[9-10]。研究比較廣泛的ISGs是OAS、ISG15、Mx、IFITM1[11-14]。

不同的IFN激活的ISGs種類不同,產(chǎn)生的抗病毒效應(yīng)亦不同,研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ和Ⅱ型IFN的聯(lián)合使用對多種病毒感染具有較好的治療效果[15],體現(xiàn)了一定的協(xié)同抗病毒效應(yīng)[16-17]。因此,本研究擬對羊OviIFN-α和OviIFN-γ基因進(jìn)行融合表達(dá),以獲得具有疊加效應(yīng)的抗病毒活性的IFN制劑。本試驗(yàn)用柔性連接臂(Linker:GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT)將OviIFN-α和OviIFN-γ序列連接構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行表達(dá),重組蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ純化后用于抗病毒活性檢測,并互相進(jìn)行比較分析,為重組蛋白生產(chǎn)工業(yè)化提供了經(jīng)驗(yàn)[18]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及主要試劑BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司;非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、牛腎細(xì)胞(MDBK)、水皰性口炎病毒(VSV)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 重組羊IFN基因的合成參照GenBank登錄的OviIFN-α序列(登錄號:X59067.1)和OviIFN-γ基因序列(登錄號:NM_001009803.1),使用Codon Adaptation tool(http://www.jcat.de/)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以及信號肽序列去除 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)。在pET32a載體中選擇酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ插入目的序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重組質(zhì)粒。OviIFN-α F/R:CGCGGATCCTGCGACCTGTCTCAGA/CCGCTCGAGCGGAGAAGACAGGTCA;OviIFN-γ F/R:CGCGGATCCCAGGGTCCGTT-CTTCA/CCGCTCGAGCATA GAAGCACGACG-A。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1[19-20]。Linker序列:5′-GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT-3′。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)用OviIFN-α F和OviIFN-γ R引物將OviIFN-γ/α序列進(jìn)行擴(kuò)增,用OviIFN-α F和OviIFN-α R引物將OviIFN-α序列進(jìn)行擴(kuò)增,用OviIFN-γ F和OviIFN-γ R引物將OviIFN-γ序列進(jìn)行擴(kuò)增,后進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物以及pET28a載體用BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,將酶切后的產(chǎn)物以及線性載體進(jìn)行酶連。構(gòu)建pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET-28a-OviIFN-γ/α 3種重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)并進(jìn)行鑒定,將陽性菌轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。鑒定后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),按體積比1∶100接種到新的LB中(含K+),37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),待D600為0.4～0.6時(shí),加入終濃度1.0 mmol/L 的IPTG,誘導(dǎo)4 h,離心收集菌體,超聲波破碎(360 W、30%、10 min)2次后,分離上清液和沉淀,制備樣品,進(jìn)行SGS-PAGE檢測,對目的蛋白可溶性進(jìn)行分析。

1.4 包涵體的純化、復(fù)性以及Western blot鑒定收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體,超聲裂解后收集沉淀,沉淀用含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌2次,然后將沉淀用10 mL 含8 mol/L尿素的變性液重懸,置冰上2 h直到包涵體溶解。4℃ 10 000r/min離心20 min收集上清,于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肏is標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白,按說明書進(jìn)行操作。使用羊抗鼠試劑盒進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。將已經(jīng)純化復(fù)性好的重組蛋白稀釋至1 g/L放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 RT-qPCR引物

1.5 重組蛋白抗病毒活性測定將Vero、MDBK細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)至單層,棄去培養(yǎng)液,分別取300 μL制備好的3種重組蛋白用900 μL含2%FBS的DMEM營養(yǎng)液進(jìn)行4-1～4-9倍比稀釋,每個(gè)梯度8個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)液,每個(gè)梯度取100 μL加至96孔板中,于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。使用細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行測定。在單層細(xì)胞上加入用2%FBS的DMEM營養(yǎng)液稀釋至100 TCID50的VSV病毒液100 μL,VSV病毒效價(jià)為1×107.45TCID50/mL。設(shè)置陰性對照組,于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察病變孔數(shù),并通過Reed-Muench法計(jì)算重組蛋白的抗病毒活性。

1.6 IFN刺激基因轉(zhuǎn)錄的水平測定使用能夠完全抑制VSV感染的重組蛋白濃度對MDBK、Vero進(jìn)行孵育,于6,12,24,48 h收集細(xì)胞,采用TRIzol抽提細(xì)胞總RNA,將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)NCBI中的基因序列信息,引用參考文獻(xiàn)中的OAS、IFIT5、Mx、IFITM1特異性引物,選用Gapdh作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。RT-qPCR反應(yīng)體系20 μL:2×Ague Green qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性20 s,58℃退火20 s,72℃延伸20 s,45個(gè)循環(huán);進(jìn)行熔解曲線分析,95℃ 10 s,65℃ 60 s,97℃ 1 s。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析通過RT-qPCR檢測后,數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法計(jì)算。通過IBM SPSS Statistics 26.0軟件,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以*0.01

2 結(jié)果

2.1 OviIFN-γ/α、OviIFN-α和OviIFN-γ重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用常規(guī)PCR,擴(kuò)增含有OviIFN-γ/α成熟肽基因的975 bp片段,含有OviIFN-α成熟肽基因的534 bp片段,含有OviIFN-γ成熟肽基因的447 bp片段。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用通用引物進(jìn)行電泳檢測,大小與預(yù)期相一致。將片段OviIFN-γ/α、OviIFN-α和OviIFN-γ經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后亞克隆至線性化載體pET28a,構(gòu)建pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α,克隆測序結(jié)果顯示所構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒基因序列與設(shè)想完全相符,編碼框正確,說明成功構(gòu)建了pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α(圖1)。

2.2 包涵體的純化及復(fù)性構(gòu)建成功的pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α重組質(zhì)粒,原核表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)情況,結(jié)果顯示(圖2),3種融合基因在大腸桿菌中都能高效表達(dá),rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ重組蛋白大小為43,26,20 kDa,而誘導(dǎo)的空載體pET28a對照則沒有相應(yīng)條帶。在當(dāng)前未進(jìn)行發(fā)酵條件和培養(yǎng)基配方優(yōu)化的條件下,同樣在1 L發(fā)酵液(LB培養(yǎng)基)中經(jīng)過分離純化后可分別獲得rOviIFN-γ/α 50 mg、rOviIFN-α 40 mg、rOviIFN-γ 40 mg。獲得融合蛋白rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ的包涵體溶液,稀釋復(fù)性后采用NanoDrop2000 測定濃度,置于-20℃ 保存。

2.3 純化蛋白表達(dá)結(jié)果以及蛋白的Western blot檢測如圖3所示,SDS-PAGE結(jié)果表明,重組蛋白經(jīng)過鎳柱純化后,rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ在43,26,20 kDa出現(xiàn)明顯單一的目的蛋白條帶,說明已成功純化出目的蛋白且沒有雜帶。rOviIFN-γ/α的表達(dá)量明顯高于rOviIFN-α和rOviIFN-γ,經(jīng)過Western blot檢測,有明顯的目的條帶。

M．DL2000 DNA Marker;1.pET28a-OviIFN-γ/α;2.pET28a-OviIFN-α;3.pET28a-OviIFN-γ

A.OviIFN-α;B.OviIFN-γ/α;C.OviIFN-γ。M.蛋白Marker;1～6.pET-28a空載未誘導(dǎo)、pET-28a空載誘導(dǎo)、全菌未誘導(dǎo)、沉淀、上清、全菌誘導(dǎo)

A.復(fù)性蛋白表達(dá)結(jié)果;B.復(fù)性蛋白的Western blot檢測。M.蛋白Marker;1.pET28a-OviIFN-α;2.pET28a-OviIFN-γ/α;3.pET28a-OviIFN-γ;4.pET28a-OviIFN-α;5.pET28a-OviIFN-γ/α;6.pET28a-OviIFN-γ

2.4 重組蛋白活性檢測應(yīng)用MDBK/VSV、Vero/VSV系統(tǒng)和細(xì)胞病變抑制法測定rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ的活性,以50%細(xì)胞病變保護(hù)率的最大稀釋度為1單位(U),根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算各種IFN的效價(jià)(表2)。檢測結(jié)果表明,3種重組IFN與一種聯(lián)合用藥方法均表現(xiàn)出顯著的抗病毒活性,能有效抑制VSV對MDBK或Vero細(xì)胞的致病作用。通過結(jié)果顯示抗病毒活性依次是: rOviIFN-γ/α>rOviIFN-α>rOviIFN-γ,且在MDBK細(xì)胞上比在Vero細(xì)胞上的活性高。

表2 抗病毒活性檢測 ×104 U/mL

2.5 IFN刺激基因轉(zhuǎn)錄水平的測定結(jié)果以0.6 g/L 的rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白質(zhì)量濃度刺激MDBK或Vero細(xì)胞,ISGs 在轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化如圖 4～6 所示。相比于對照組,重組蛋白顯著增加了 5 種 ISGs 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。以rOviIFN-γ蛋白刺激 MDBK、Vero細(xì)胞,ISG15、MX1、OAS和IFITM1 的轉(zhuǎn)錄水平在 12 h 達(dá)到最高水平,與對照組相比差異極顯著(P<0.01),且對2種細(xì)胞中4種ISG的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較,MDBK細(xì)胞中4種ISG的轉(zhuǎn)錄水平比Vero細(xì)胞要高。以rOviIFN-α蛋白刺激 MDBK、Vero細(xì)胞,ISG的轉(zhuǎn)錄水平與對照組在12 h相比差異極顯著(P>0.05),ISG15、MX1、OAS和IFITM1的轉(zhuǎn)錄水平在12 h達(dá)到最高水平。在Vero細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),ISG15轉(zhuǎn)錄水平在6 h達(dá)到最高水平。MDBK細(xì)胞中4種ISG的轉(zhuǎn)錄水平比Vero細(xì)胞要高。以rOviIFN-γ/α蛋白刺激MDBK、Vero細(xì)胞,ISG的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比在12 h時(shí)差異極顯著(P>0.05)。通過結(jié)果圖將3種蛋白以及1種蛋白聯(lián)合使用方式進(jìn)行比較,結(jié)果顯示ISG轉(zhuǎn)錄依次是: rOviIFN-γ/α>rOviIFN-α>rOviIFN-γ。

用OviIFN-γ處理Vero和MDBK細(xì)胞不同時(shí)間,對照組為未經(jīng)處理的Vero和MDBK細(xì)胞,并將GAPDH設(shè)為內(nèi)源性對照,以上數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)(與對照組相比,*表示P<0.050,**表示P<0.010,***表示P<0.001)。下同

圖5 OviIFN-α誘導(dǎo)Vero和MDBK細(xì)胞表達(dá)MX1、ISG15、IFITM1和OAS

圖6 OviIFN-γ-α誘導(dǎo)Vero和MDBK細(xì)胞表達(dá)MX1、IFITM1、ISG15和OAS

3 討論

為了研究羊IFN(OviIFN-α、OviIFN-γ)融合表達(dá)對抗病毒活性疊加的作用,本試驗(yàn)構(gòu)建了pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α質(zhì)粒,使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá),獲得重組IFN。

ECHEBLI等[21]提出在病毒感染過程中的急性或慢性感染階段大多數(shù)ISG都能被Ⅰ和Ⅱ型IFN誘導(dǎo),并表現(xiàn)出最高的增加作用,表明Ⅰ和Ⅱ型IFN之間有很強(qiáng)的協(xié)同作用。張小南[22]應(yīng)用 Affymetrix cDNA 基因芯片技術(shù)檢測了Huh7細(xì)胞在IFN-α、IFN-γ單獨(dú)以及聯(lián)合處理6 h后基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果顯示,在IFN聯(lián)合處理后,細(xì)胞內(nèi)IFN誘導(dǎo)基因譜有明顯加強(qiáng),參與抗病毒及免疫反應(yīng)。通過 RT-PCR 證實(shí), BcIG(Bcl -2 family protein G)、XAFI(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor-1)、TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)、TAP1(ransporter 1)的轉(zhuǎn)錄在聯(lián)合處理時(shí)比IFN-α或IFN-γ單獨(dú)處理有極為顯著的加強(qiáng),說明IFN聯(lián)合使用能誘發(fā)宿主產(chǎn)生強(qiáng)大的胞內(nèi)抗病毒活性。

鄭鳴等[23]將豬IFN-α與IFN-γ進(jìn)行融合表達(dá)獲得rPoIFN-α/γ,與PoIFN-α、PoIFN-γ進(jìn)行抗病毒活性測定,證明經(jīng)純化復(fù)性得到的rPoIFN-α/γ有抗病毒活性,且抗VSV活性rPoIFN-α/γ明顯高于非融合的PoIFN-α、PoIFN-γ,體現(xiàn)了一定的抗病毒疊加效應(yīng)。本試驗(yàn)通過細(xì)胞病變抑制法將rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白在2套細(xì)胞系統(tǒng)MDBK、Vero中進(jìn)行試驗(yàn),每組試驗(yàn)組都使用300 μL的重組蛋白進(jìn)行細(xì)胞孵育。較鄭鳴等[23]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)組,本試驗(yàn)更充分、更完善,在Vero-VSV系統(tǒng)中,Vero細(xì)胞自身并不能表達(dá)分泌IFN蛋白,說明在本系統(tǒng)中3組試驗(yàn)組產(chǎn)生的抗病毒活性與內(nèi)源性IFN無關(guān)。較李丹等[24]等報(bào)道的在BHK細(xì)胞中進(jìn)行DviIFN-α抗病毒活性測定有更強(qiáng)的說服力,排除了內(nèi)源性IFN產(chǎn)生抗病毒作用的可能性。本試驗(yàn)將IFN聯(lián)合使用與IFN融合表達(dá)2種方式進(jìn)行對比,以獲得Ⅰ與Ⅱ型IFN最高的疊加抗病毒活性。rOviIFN-γ/α蛋白的獲得是在整個(gè)試驗(yàn)的上游對OviIFN-α和OviIFN-γ的序列進(jìn)行改造,通過Linker進(jìn)行連接獲得,使OviIFN-α和OviIFN-γ起到一定的疊加效應(yīng)。3組試驗(yàn)組蛋白用量與所測IFN活性用量一致,取在6,12,24,48 h的Vero和MDBK細(xì)胞用1 mL的TRIzol進(jìn)行RNA的提取,通過RT-qPCR檢測不同細(xì)胞、不同時(shí)間段中ISG15、MX1、OAS和IFITM1 的轉(zhuǎn)錄水平,這些ISGs轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)說明了在mRNA水平上這4種ISG表達(dá)水平升高。

將rOviIFN-α與rOviIFN-γ 進(jìn)行聯(lián)合使用,采用rOviIFN-α(170 μL)、rOviIFN-γ(130 μL),在MDBK細(xì)胞、Vero細(xì)胞使用VSV進(jìn)行抗病毒活性測定,其活性為2.83×104,3.42×104U/mL。通過將單個(gè)蛋白進(jìn)行聯(lián)合使用與融合蛋白進(jìn)行比較,結(jié)果顯示聯(lián)合使用比融合表達(dá)的蛋白抗病毒活性略高,但抗病毒活性仍保持在1個(gè)數(shù)量級且無明顯差異;并且聯(lián)合使用在生產(chǎn)過程中,成本更高,并不利于生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此本試驗(yàn)將2種蛋白融合表達(dá)作為重點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

綜上所述,rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白3組試驗(yàn)組在體外有良好的抗病毒活性,且使ISGs轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,3組試驗(yàn)組通過抗病毒活性的比較也顯示出了一定的疊加效應(yīng)。本試驗(yàn)設(shè)置試驗(yàn)組廣泛、全面,試驗(yàn)設(shè)計(jì)的細(xì)胞使用種類排除了內(nèi)源性因素的影響,且該試驗(yàn)主要集中在體外水平進(jìn)行評價(jià)。