郭 兵,王海鳳,李 妍,張 玥,陳 彪,秦建華*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛健康養(yǎng)殖重點實驗室(部省共建),河北 保定 071000;2.河北北方學(xué)院 動物科技學(xué)院,河北 張家口 075000)

牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是世界范圍內(nèi)引起牛呼吸道疾病綜合征的重要病原之一,是導(dǎo)致牛下呼吸道感染的首要原因[[1-2]。感染牛臨床可見鼻腔和眼睛分泌物滲出、發(fā)熱、咳嗽、氣喘和呼吸困難等癥狀[3],病死牛剖檢可見不可逆性肺損傷如肺水腫、肺氣腫和間質(zhì)性肺炎等病理性變化[4]。牛感染BRSV后,病毒長期存在于體內(nèi)引起持續(xù)感染,使牛的免疫力下降,最終導(dǎo)致牛呼吸道合胞體病暴發(fā)[5]。該病發(fā)病率高,死亡率低,但受到外界因素(溫度、斷奶和混群等)刺激死亡率明顯升高,給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,是養(yǎng)牛業(yè)面臨的重大難題[6]。臨床上BRSV的一些非典型癥狀常與牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)等病原感染引起的臨床癥狀極為相似,給臨床診斷帶來難度[7],因此建立有效的BRSV檢測方法對牛呼吸道合胞病的防控具有重要意義。

國內(nèi)外已建立的BRSV定量檢測方法靶基因均為N基因。韋佳塔等[8]針對BRSV N 基因建立了熒光定量PCR檢測方法,UEHARA等[9]建立了針對N基因的液滴-實時熒光定量PCR方法。然而,隨著病毒不斷發(fā)生變異,上述檢測技術(shù)亦受到了挑戰(zhàn)。BRSV F蛋白介導(dǎo)宿主細(xì)胞與病毒的融合,增強(qiáng)病毒的穿透力,將核衣殼傳遞到細(xì)胞質(zhì)中[10],還可以促進(jìn)受感染細(xì)胞和臨近細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)而形成合胞體,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答[11]。F蛋白具有高度的穩(wěn)定性,不同毒株間的部分序列分析表明核苷酸和氨基酸變異程度分別為0.8%和1.8%[12]。國外早在1994年已有以F基因作為目的基因建立巢氏PCR診斷方法的報道[13],國內(nèi)史鴻飛等[14]針對BRSV融合蛋白F基因建立了套式RT-PCR方法,但國內(nèi)、外以F基因建立的檢測方法均不能進(jìn)行定量檢測。

綜上,本研究針對BRSV F基因高度保守區(qū)建立TB Green Ⅱ 熒光定量PCR檢測方法,以期增加該病毒檢測的候選基因,為牛呼吸道合胞體病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒cDNA和臨床被檢樣品及主要試劑IBRV cDNA、BVDV cDNA,從鼻拭子、抗凝血和肺臟組織勻漿3種樣品中分離鑒定的BRSV cDNA,均由本實驗室保存;50份出現(xiàn)明顯臨床癥狀疑似感染BRSV病牛的抗凝血、鼻拭子和死亡牛只的肺臟樣品采集于河北省高寒地區(qū)(張北、尚義和康?？h)養(yǎng)牛場;TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物技術(shù)(北京)有限公司;病毒基因組RNA提取試劑盒購自廣州飛揚生物工程有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成參考GenBank中BRSV(M58350.1、MN316656.1、AJ971803.1)核酸序列,選擇F基因設(shè)計熒光定量PCR特異性引物,引物序列F:5′-AGTTGACACTGTATCCGTTGG-3′;R:5′-ACTCATCGGAAGGAAACA-3′,擴(kuò)增長度為125 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒的制備以BRSV的 cDNA為模板,用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行BRSV目的片段擴(kuò)增;將瓊脂糖凝膠回收的目的片段與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,重組質(zhì)粒命名為pMD19T-BRSV-gF;挑取白色單菌落增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Sal Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定(目的基因為125 bp,質(zhì)粒為2 692 bp);對雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)一步做測序鑒定;將上述鑒定正確的重組質(zhì)粒作為繪制BRSV標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板;用酶標(biāo)儀測定測重組質(zhì)粒濃度和純度,計算拷貝數(shù),公式為:拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×6.02 × 1023×10-9/(660×質(zhì)粒長度)。

1.4 TB Green Ⅱ熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化分別設(shè)置51,52,53,54,55,56,57℃作為退火溫度優(yōu)化反應(yīng)條件,分析擴(kuò)增曲線,確定最佳退火溫度;運用優(yōu)化后的退火溫度,設(shè)置0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 μL 進(jìn)行引物體積摸索,確定反應(yīng)的最佳引物量,反應(yīng)結(jié)束后制作熔解曲線。

1.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將BRSV重組質(zhì)粒作10倍梯度稀釋,選取6個連續(xù)稀釋濃度質(zhì)粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作為模板,每個濃度設(shè)3個重復(fù),以ddH2O作為陰性對照,以1.4優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)結(jié)束后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 敏感性試驗將BRSV重組質(zhì)粒作10倍梯度稀釋,選取6個連續(xù)稀釋濃度質(zhì)粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作為模板,每個濃度做3個重復(fù),以ddH2O作為陰性對照,進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,通過觀察熒光擴(kuò)增曲線獲得BRSV重組質(zhì)粒最低檢出濃度。

1.7 特異性試驗采用建立的熒光定量PCR方法分別對BRSV、BVDV和IBRV 的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,同時設(shè)ddH2O為陰性對照,通過觀察PCR擴(kuò)增曲線評價所建方法的特異性,被檢樣品出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線判為陽性,無明顯擴(kuò)增曲線判為陰性。

1.8 重復(fù)性試驗選取4個連續(xù)稀釋濃度BRSV重組質(zhì)粒 (3.9×103～3.9×106copies/μL) 作為模板,用熒光定量PCR方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗,每個濃度設(shè)3個重復(fù),統(tǒng)計Cq 值并計算標(biāo)準(zhǔn)差,通過對變異系數(shù)(CV)分析評估所建方法重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測按照RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對50份抗凝血、鼻拭子和肺臟臨床樣品進(jìn)行BRSV RNA提取和cDNA 反轉(zhuǎn)錄。利用熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法(黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn),DB23/T)進(jìn)行BRSV病原檢測,比較2種方法的陽性檢出率和符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后,凝膠電泳得到約125 bp片段,與預(yù)期目的基因片段大小相符,且載體片段與理論值相符(2 692 bp)(圖1);經(jīng)BLAST檢索,與GenBank中參考序列一致,說明BRSV重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度為120.4 mg/L,根據(jù)公式計算得出重組質(zhì)?？截悢?shù)為3.9×1010copies/μL。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對退火溫度和引物體積優(yōu)化,確定TB Green Ⅱ熒光定量PCR方法反應(yīng)體系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2.0 μL,ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL,ddH2O 6.0 μL。BRSV熔解曲線溫度為83℃,最佳擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 30 s;95℃ 5 s,55℃ 34 s,共40個循環(huán)(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.pMD19T-BRSV-gF雙酶切產(chǎn)物;2.陰性對照

A.51～57℃退火溫度時的擴(kuò)增曲線;B.51～57℃退火溫度時的融解曲線;C.上、下游引物各0.8 μL時的擴(kuò)增曲線;D.上、下游引物各0.8 μL時的融解曲線;紅色箭頭.最優(yōu)條件

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以梯度稀釋的BRSV重組質(zhì)粒為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。重組質(zhì)粒模板拷貝數(shù)在3.9×101～3.9×106copies/μL范圍內(nèi),與Cq值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.256 1,相應(yīng)的回歸方程為y=-3.256 1x+32.338 0,相關(guān)系數(shù)R2=0.995 2,擴(kuò)增率為103%。

圖3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR敏感性試驗選取6個連續(xù)稀釋濃度質(zhì)粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,BRSV重組質(zhì)粒出現(xiàn)良好的S型熒光擴(kuò)增曲線,陰性對照組無擴(kuò)增曲線,BRSV重組質(zhì)粒的最低檢出濃度達(dá)3.9×101copies/μL(圖4)。

1～6.質(zhì)粒濃度依次為3.9×101～3.9×106 copies/μL;7.陰性對照

2.5 熒光定量PCR特異性試驗利用建立的熒光定量PCR方法對IBRV、BVDV和BRSV的cDNA進(jìn)行檢測,從鼻拭子、抗凝血和肺臟組織勻漿3種樣品中分離出的BRSV cDNA 均擴(kuò)增出典型的“S”型擴(kuò)增曲線,IBRV cDNA、BVDV cDNA和陰性對照均無特異性擴(kuò)增(圖5)。

1.鼻拭子BRSV擴(kuò)增曲線;2.肺臟組織勻漿BRSV擴(kuò)增曲線;3.抗凝血BRSV擴(kuò)增曲線;4.BVDV擴(kuò)增曲線;5.IBRV擴(kuò)增曲線;6.陰性對照組擴(kuò)增曲線

2.6 熒光定量PCR重復(fù)性試驗用熒光定量PCR方法對4個濃度(3.9×103～3.9×106copies/μL)的BRSV重組質(zhì)粒進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(表1),批內(nèi)Cq 值的CV為0.7%～1.9%,批間Cq 值的CV為0.9%～1.8%,均小于2.0%。

2.7 臨床樣品檢測用建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法對50份臨床樣品進(jìn)行檢測,熒光定量PCR對BRSV的陽性檢出率為26%(13/50),常規(guī)PCR陽性檢出率為14%(7/50),2種方法總符合率為88%(44/50),陽性符合率為100%(7/7),陰性符合率86%(37/43) (表2)。

表1 熒光定量PCR重復(fù)性試驗

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)靈敏性較高,特異性較強(qiáng),近年來廣泛應(yīng)用于畜禽病原的檢測[15-16]。常用的熒光定量PCR方法有熒光標(biāo)記探針法和熒光染料法,探針法需要合成探針,費用昂貴;染料法無需合成探針,操作簡單,檢測成本較低,臨床應(yīng)用更為廣泛。TB Green Ⅱ熒光染料對雙螺旋DNA的結(jié)合高度專一,能很好地抑制cDNA中殘存的mRNA活性,避免mRNA對PCR反應(yīng)的影響,是常用的一種熒光染料。

因此,本研究以TB Green Ⅱ為熒光染料,選擇BRSV 的F基因設(shè)計特異性引物,通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,成功建立熒光定量PCR方法。特異性試驗中選擇臨床癥狀容易混淆的BVDV和IBRV作為陽性對照,結(jié)果顯示在肺臟組織勻漿、鼻拭子和抗凝血3種樣品中均特異性檢測出BRSV,BVDV和IBRV檢測均為陰性,說明本方法對BRSV特異性較高。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的CV均小于2%,該方法具有良好的重復(fù)性和可操作性。本研究建立的熒光定量PCR檢測方法對BRSV的最低檢測限可達(dá)3.9×101copies/μL,與趙毅[17]建立的熒光定量PCR檢測方法(BRSV最低檢出限為1.02×102copies/μL),姜曉霞等[18]建立的實時熒光定量PCR方法(BRSV最低檢出限1.02×102copies/μL)和魏碩佟等[19]建立的BRSV多重PCR方法(BRSV最低檢測限1.0×104copies/μL)相比,敏感性更好,分別提高了2.5,2.5,256.4倍。采用熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法對50份采集樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示熒光定量PCR 對BRSV陽性檢出率(26%)明顯優(yōu)于常規(guī)PCR(14%),陽性符合率為100%,能夠滿足BRSV臨床檢測的要求。

綜上所述,本研究建立的熒光定量PCR檢測方法可應(yīng)用于臨床檢測中,為臨床上選擇合適的BRSV檢測方法提供參考以及對牛呼吸道合胞體病的流行病學(xué)調(diào)查和防控提供技術(shù)支持。