黃燕 裴晉紅 李鈺娜 栗學(xué)清 武翠玲 鄭軍 王博 宋麗華

1.長治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000 2.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長治 046000

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)于1993年George在牙齒中首次發(fā)現(xiàn)而得名[1]，后期發(fā)現(xiàn)骨組織中，DMP1的表達(dá)水平顯著高于牙本質(zhì)[2]。DMP1在調(diào)節(jié)骨、牙齒礦化，體內(nèi)磷水平穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[3-4]。離體實驗顯示，DMP1作為轉(zhuǎn)錄因子或胞外整合素配體，通過激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控成骨細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[5]。近來，多項研究表明，一部分DMP1進(jìn)入了細(xì)胞核，但其在核內(nèi)的調(diào)控機(jī)制仍需探討[6]。本文通過生物信息學(xué)方法分析DMP1的結(jié)構(gòu)和功能，為深入研究該蛋白的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

從NCBI的Gen-Bank數(shù)據(jù)庫獲得DMP1蛋白的 513個氨基酸的序列信息，進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

1.2 方法

登陸在線軟件，輸入DMP1氨基酸序列，通過各參數(shù)分析并預(yù)測DMP1蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能。如：登陸Expert Protein Analysis System數(shù)據(jù)庫，采用其中的Prot Param Tool工具分析DMP1的理化性質(zhì)；Prort Scale Tool工具分析DMP1的親疏水性質(zhì)；SPORTII分析DMP1的亞細(xì)胞定位；Signal P 4.0軟件分析DMP1信號肽，NLStradamus工具預(yù)測該蛋白的核定位信號；TMHMM 2.0分析DMP1的跨膜區(qū)域；SOPMA工具分析DMP1的二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)；Net Phos 3.1在線預(yù)測DMP1蛋白磷酸化位點；Net Nglyc 1.0 Server 在線預(yù)測DMP1蛋白N-糖基化位點；通過STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建DMP1的蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；JASPAR預(yù)測可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；Bio GPS數(shù)據(jù)庫分析DMP1在人體正常組織中的表達(dá)情況；通過NCBI BLAST在線選擇比對序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 Dmp1基因的編碼產(chǎn)物分析

人Dmp1基因定位于4q22.1，包括7個外顯子，有4中不同剪切方式，編碼產(chǎn)物見表1，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物NM_004407.3全長2 693 bp，其相應(yīng)的編碼產(chǎn)物NP_004398.1為513個氨基酸組成的DMP1的共識序列。

表1 Dmp1 基因可變剪切產(chǎn)物Table 1 Alternative transcripts of Dmp1 gene

2.2 DMP1的理化性質(zhì)分析

登陸ExPASy網(wǎng)站，采用Prot Param工具分析獲得DMP1蛋白分子式為C2232H3458N674O987S8，相對分子量是55782.41 Da，絲氨酸含量最高，占到整個序列的21.4%。多處存在磷酸化及O-糖基化修飾位點。DMP1的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為86.69，歸類為不穩(wěn)定蛋白。DMP1序列中的酸性氨基酸-Asp和Glu共142個，堿性氨基酸-Arg、Lys及His共51個，理論上的等電點為4.00，表明DMP1是一種酸性蛋白質(zhì)。

Prot Param 分析得到，DMP1的脂肪系數(shù)為33.47，平均親水性是-1.598；登陸ExPASy網(wǎng)站，采用Prort Scale軟件分析，DMP1最強(qiáng)親水位點在第104位的天冬氨酸，分值-3.544，第7位的亮氨酸疏水性最強(qiáng)，分值2.600?？v觀DMP1序列中所有氨基酸的親疏水性質(zhì)，如圖1所示，親水多于疏水，表明DMP1是親水性蛋白質(zhì)。

圖1 DMP1 蛋白的親-疏水性分析Fig.1 Hydrophilic-hydrophobic analysis of DMP1 protein

2.3 DMP1蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析

通過SPORTⅡ預(yù)測，DMP1蛋白定位于細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的可能性分別為55.6%、22.2%和22.2%。

圖2 DMP1蛋白信號肽分析Fig.2 Signal peptide analysis of DMP1

2.4 DMP1蛋白的信號肽、核定位信號及跨膜區(qū)分析

利用Signal P 4.1在線分析DMP1蛋白的信號肽序列，如圖2所示。原始剪切位點C值最大切割點在第17個氨基酸殘基位置，分值0.810；Y值即被結(jié)合的剪切點最高點在第17位氨基酸，分值為0.880；第10個氨基酸處為信號肽分值最高位點，分值0.972；1～16位氨基酸平均信號肽分值為0.918，能夠形成經(jīng)典的信號肽區(qū)域。運(yùn)用NLStradamus工具預(yù)測蛋白的核定位信號，結(jié)果顯示不存在核定位信號序列，見圖3。TMHMM Server v.2.0在線預(yù)測，DMP1蛋白序列中無跨膜區(qū)，見圖4。

圖3 DMP1核定位信號分析Fig.3 NLS analysis of DMP1

圖4 DMP1跨膜區(qū)域分析Fig.4 Analysis of transmembrane region of DMP1

2.5 DMP1蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA預(yù)測DMP1的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示多肽鏈中α-螺旋占15.79%，無規(guī)卷曲占76.41%，延伸鏈占5.07%，β-轉(zhuǎn)角占2.73%，其中無規(guī)卷曲占主導(dǎo)(圖5)；SWISS-MODEL在線預(yù)測DMP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，如圖6所示。

圖5 DMP1的二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Secondary structure prediction of DMP1

圖7 DMP1蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of DMP1 protein

圖6 DMP1的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of tertiary structure of DMP1 protein

2.6 DMP1蛋白磷酸化位點預(yù)測

NetPhos 3.1在線預(yù)測DMP1蛋白磷酸化位點，見圖7。結(jié)果表明，DMP1含有123個潛在的磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點最多，有106個；蘇氨酸磷酸化位點12個；酪氨酸磷酸化位點5個。除酪氨酸外的118個潛在磷酸化位點也是O-糖基化位點。

2.7 DMP1蛋白N-糖基化位點預(yù)測分析

NetNglyc 1.0 Server 在線軟件預(yù)測DMP1蛋白N-糖基化位點，見圖8，結(jié)果顯示， DMP1蛋白序列中存在8個潛在N-糖基化位點。

圖8 DMP1蛋白N-糖基化位點預(yù)測Fig.8 Prediction of N-glycosylation sites of DMP1

2.8 蛋白質(zhì)相互作用、Dmp1基因5’非翻譯區(qū)分析

STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測與DMP1相互作用的蛋白，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9，包括整合素α-V(ITGAV)、E1A 結(jié)合蛋白p300(EP300)、整合素β3(ITGB3)、Jun B原癌基因(JUNB)、成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)、外源核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)、整合素結(jié)合的唾液酸蛋白(IBSP)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、X連鎖的磷酸調(diào)節(jié)內(nèi)肽酶同系物(PHEX)、TAF2 RNA聚合酶II (TAF2)，DMP1蛋白與這10種蛋白的相關(guān)系數(shù)分別為0.905、0.903、0.901、0.900、0.838、0.762、0.732、0.727、0.687、0.628，JASPAR分析顯示JUNB作為轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合Dmp1基因5’非翻譯區(qū)(表2)調(diào)控DMP1的表達(dá)。此外，Myc、Eip74EF、SP1、Bcl6、Myb等轉(zhuǎn)錄因子都具有潛在結(jié)合位點，進(jìn)一步提示DMP1的表達(dá)受到多種因素的影響。

表2 轉(zhuǎn)錄因子JUNB的DNA潛在結(jié)合位點Table 2 DNA Binding sites of transciption factor JUNB

圖9 DMP1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Protein-protein interaction network for DMP1

2.9 DMP1在人體正常組織中的表達(dá)

BioGPS數(shù)據(jù)庫顯示，DMP1蛋白在人體各正常組織均有表達(dá)，其中在心肌和骨骼肌中含量較高，如圖10所示。提示DMP1具有重要的生物學(xué)功能，但目前對其功能還缺乏進(jìn)一步了解。

圖10 DMP1在人體各組織中的表達(dá)Fig.10 Expression of DMP1 in different human tissues

2.10 DMP1的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI中BLAST分析，選擇奇蹄目、食肉目、嚙齒目、靈長目及偶蹄目動物序列直接建樹，見圖11。結(jié)果與物種進(jìn)化程度一致，人DMP1蛋白在靈長類動物中具有保守的分子功能。

圖11 DMP1蛋白分子進(jìn)化樹Fig.11 The phylogenetic tree of human DMP1 protein

3 討論

DMP1屬于小整合素結(jié)合配體N-糖蛋白家族成員，不僅表達(dá)于牙齒和骨組織，腦、心肌、肝臟等非礦化組織也有表達(dá)[7]。DMP1不僅可以誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[8-9]，還可以通過調(diào)節(jié)FGF23來平衡體內(nèi)磷酸鹽代謝[10]；在成骨細(xì)胞分化的早期階段，c-Jun調(diào)控Dmp1基因的轉(zhuǎn)錄，但在成骨細(xì)胞分化末期，c-Jun的作用并不顯著。有研究顯示，礦化過程中，c-Jun與調(diào)節(jié)蛋白p300相互作用，結(jié)合在啟動子區(qū)，協(xié)同調(diào)節(jié)Dmp1基因的表達(dá)[11]；過表達(dá)Runx2能誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞中Dmp1基因的表達(dá)[12]；lncRNA32865作用于Dmp1基因啟動子區(qū)調(diào)控Dmp1的基因表達(dá)[13]；DMP1在Hacat細(xì)胞和口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)存在差異[14]；卵巢去勢骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨中Dmp1 mRNA表達(dá)水平明顯下降[15]；DMP1參與大鼠下頜前移過程中髁突軟骨的適應(yīng)性重塑，促進(jìn)髁突軟骨內(nèi)成骨和軟骨增殖[16]。以上研究表明，DMP1在骨代謝、腎的礦物質(zhì)代謝、腫瘤的發(fā)生等方面均有影響，但其作用的分子機(jī)制尚未完全明了。

本研究基于生物信息學(xué)分析和預(yù)測DMP1的結(jié)構(gòu)與功能，結(jié)果提示，人DMP1蛋白是酸性親水蛋白，有信號肽，無跨膜區(qū)；主要二級結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)卷曲；具備豐富的磷酸化位點及糖基化位點；具有利于蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)特點及多種轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點，人體各組織均有表達(dá)。

綜上所述，提示DMP1多數(shù)為游離存在的酸性分泌性蛋白；無規(guī)卷曲占主導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)元件表明DMP1具有疏松的結(jié)構(gòu)特征，為與其他分子的相互作用提供了便利；多種修飾位點的存在為其功能活性的改變提供了更多可能；在人體各組織的廣泛性表達(dá)，為其發(fā)揮重要的生物學(xué)功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本文分析和預(yù)測DMP1的結(jié)構(gòu)和功能，對明確DMP1作用的分子機(jī)制具有參考意義。