李宇偉,連瑞麗,馬夢菲,張桂枝,婁 飛,曲書昊

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物醫(yī)藥學院,河南 鄭州 450046;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物科技學院,河南 鄭州 450046;3.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046)

規(guī)模化養(yǎng)殖中抗生素的濫用,使得藥物殘留超標,嚴重影響食品安全,威脅人類健康。植物精油來源于天然植物,具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等多種作用[1,2],植物精油作為替抗功能性添加劑產(chǎn)品之一,引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。百里香酚具有促進生長[3]、抑菌消炎[4,5]、抗氧化[6,7]、提高免疫力等藥理作用[6-8],但其穩(wěn)定性差、易揮發(fā),直接應用于畜禽疾病防控存在很大的局限性,不能達到預期的效果。微囊是固態(tài)或液態(tài)藥物被壁材包裹成圓球形,使藥物到達靶細胞后緩慢釋放藥物,減少藥物對胃腸道的損傷,減少毒副作用,使藥物穩(wěn)定性增強等[9-11]。本試驗通過百里香酚的微囊包被技術(shù),采用單因素試驗與正交試驗優(yōu)化百里香酚微囊的制備工藝,并對微囊進行質(zhì)量評價,為植物精油“替抗”產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百里香酚購自天津市科密歐化學試劑有限公司;殼聚糖、50%戊二醛、阿拉伯膠購自天津市科密歐化學試劑有限公司;無水乙醇購自德州曼巴商貿(mào)有限公司;10%氫氧化鈉溶液購自西隴科學股份有限公司;10%醋酸溶液購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 主要試驗儀器

101-3A型電熱鼓風干燥箱購自天津市泰斯特儀器有限公司;85-2A型磁力攪拌器購自常州潤滑有限公司;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SQP型萬分之一電子天平購自賽多利斯科學儀器北京有限公司;TU-1810SPC型紫外-可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司;CKX53型倒置相差熒光顯微鏡購自奧林巴斯公司中國公司;ZRS-8G型溶出度測定儀購自天津市精拓儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百里香酚微囊的制備

采用復凝聚法制備百里香酚微囊[12,13],稱量0.5 g殼聚糖置于燒杯中,加入10%的醋酸溶液攪拌至充分溶解;再稱量2 g阿拉伯膠于燒杯中,加入40 ℃的純水稀釋使其完全溶解。準確稱取0.5 g百里香酚,倒入阿拉伯膠溶液中,不斷攪拌直至初乳形成。取上述阿拉伯膠和百里香酚乳劑置于燒杯中,加入殼聚糖溶液混合均勻后水浴加熱。用10%的氫氧化鈉,調(diào)節(jié)pH至4.0,顯微鏡下觀察是否有百里香酚微囊生成。攪拌5 min,加入適量50%的戊二醛,再用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0,繼續(xù)攪拌0.5 h。微囊靜置過夜,棄去上清液,抽濾,并用純水洗滌至微囊表面無戊二醇氣味,在40 ℃烘箱中干燥16 h,得到百里香酚微囊,稱量后計算收率和包封率。

1.3.2 微囊中百里香酚的包封率及收率的測定

分別取3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg、5 mg百里香酚置于100 mL容量瓶,定容至刻度線并搖勻,測定吸光度,計算百里香酚的含量。因殼聚糖和阿拉伯膠均不溶于乙醇,也不溶于水,可通過測定微囊樣品上清液中百里香酚的含量,得到微囊的包封率[14,15]。

1.3.3 單因素試驗優(yōu)化百里香酚微囊的制備工藝

以包封率為評價指標,殼聚糖和阿拉伯膠為囊材[16],百里香酚為囊芯,戊二醛為固化劑,選擇芯壁比、壁材比和壁材濃度三個因素,進行單因素試驗。

1.3.3.1 最佳芯壁比

分別添加0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g百里香酚(芯壁比為3∶25、7∶50、4∶25、9∶50、1∶5)、進行試驗,并計算包封率,選擇最優(yōu)的芯壁比進行下一個單因素試驗。

1.3.3.2 最佳壁材比

根據(jù)1.3.3.1所得最佳芯壁比,以殼聚糖和阿拉伯膠的比例為4∶21、9∶41、1∶4、11∶39、6∶19進行試驗,計算包封率,選擇最優(yōu)的壁材比進行下一個單因素實試驗。

1.3.3.3 最佳壁材濃度

根據(jù)1.3.3.1和1.3.3.2所得最佳芯壁比、壁材比使用量,以壁材的濃度為0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL進行試驗,計算包封率,選擇最優(yōu)的壁材濃度。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化百里香酚微囊的制備工藝

以包封率為評價標準,通過單因素試驗篩選出最優(yōu)的芯壁比、壁材比、壁材濃度,設計三因素三水平的正交試驗,并對百里香酚微囊正交試驗結(jié)果進行綜合評價,從而得出制備百里香酚微囊的最佳工藝條件。百里香酚微囊正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 百里香酚微囊最佳制備工藝的驗證試驗

對1.3.4正交試驗所得最優(yōu)工藝參數(shù)進行三組平行試驗,對結(jié)果進行驗證。

1.3.6 百里香酚微囊的質(zhì)量評價

1.3.6.1 百里香酚微囊的溶出度評價

根據(jù)《中華人民共和國藥典》中測量溶出度的方法[17],量取9 mL濃鹽酸置于含有純水的燒杯中,邊到濃鹽酸邊攪拌,并加水至1000 mL,將稀鹽酸超聲脫氣0.5 h,倒于溶出度測定儀中,相同方法配制5份稀鹽酸備用。分別稱取1 g百里香酚微囊兩份、0.3935 g百里香酚、芯材和壁材物理混合物(0.5664 g殼聚糖、1.7946 g阿拉伯膠、0.3935 g百里香酚),對應地置于2、3、4、5號稀鹽酸溶液中,1號稀鹽酸溶液設為空白對照。溶出度測定儀溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min。分別測定其在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min、135 min時的吸光度。

式中:An-不同時間點溶液對應的吸光度;

A-加入總藥物的吸光度;

V-溶出介質(zhì)的總體積;

V1-各時間點所取溶液的體積。

1.3.6.2 百里香酚微囊的形態(tài)分布評價

分別取少量百里香酚微囊、阿拉伯膠、殼聚糖、百里香酚、芯材和壁材混合物置于光學顯微鏡下觀察各組的形態(tài),判斷是否有微囊形成。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香酚標準曲線的確定

對百里香酚在波長為200～400 nm的范圍進行掃描,紫外光譜圖如圖1所示,百里香酚原料藥的最大吸收波長均為274 nm。通過紫外測得各濃度的吸光度分別是0.394、0.440、0.528、0.591、0.646,得到回歸方程:y=0.0131x-0.0042(相關(guān)系數(shù)R2=0.9918),如圖2所示,說明百里香酚在30～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

圖1 百里香酚的紫外吸收波長圖

2.2 百里香酚微囊的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 芯壁比對百里香酚微囊的影響

因素A是芯壁比、因素B是壁材比、因素C是壁材濃度,固定攪拌速度為450 r/min、溫度為40 ℃、固化劑用量為1 mL、壁材比為1∶4、壁材濃度為0.0156 g/mL,芯壁比為3∶25、7∶50、4∶25、9∶50、1∶5進行試驗。結(jié)果如表2所示,在該芯壁比范圍內(nèi),包封率隨著芯材量的增加而提高,百里香酚為0.5 g時包封率最高,故芯壁比選擇1∶5。

2.2.2 壁材比對百里香酚微囊的影響

芯壁比為1∶5、壁材比分別為4∶21、9∶41、1∶4、11∶39、6∶19進行試驗。結(jié)果如表3所示,在此范圍內(nèi),隨著壁材比的增加包封率、收率也隨之增加,當壁材比為6∶19時包封率和收率又降低,可能由于乳劑的黏度太高使得囊殼的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,易被破壞,故最佳壁材比是11∶39。

表3 壁材比對百里香酚微囊的影響

2.2.3 壁材濃度對百里香酚微囊的影響

芯壁比為1∶5、壁材比為11∶39,壁材濃度分別為0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL進行試驗,結(jié)果如表4所示,最佳壁材濃度為0.0208 g/mL。

2.3 百里香酚微囊的正交試驗結(jié)果

因素A是芯壁比(A1:1∶5,A2:9∶50,A3:4∶25,)、因素B是壁材比(B1:1∶4,B2:11∶39,B3:6∶19)、因素C是壁材濃度(C1:0.0208 g/mL,C2:0.0179 g/mL,C3:0.0156 g/mL),以綜合評價為指標可得出各個因素下的k值大小,表5的試驗結(jié)果表明,因素A的最大k值是k1(98.47)、因素B的最大k值是k2(99.36)、因素C的最大k值是k1(98.68),通過極差可知,對微囊的綜合評價影響最大的是因素B,影響最小的是因素C。方差分析結(jié)果如表6所示,因素A的P值是0.057954、因素B的P值是0.059238、因素C的P值是0.102978,因素A和因素B的P值都大于0.05且小于0.1,故百里香酚的投藥量、百里香酚與阿拉伯膠和殼聚糖的投藥比對百里香酚微囊的包封率有一定的影響,但是壁材的濃度對百里香酚微囊的包封率無影響。通過正交試驗和方差分析綜合考慮,認為制備百里香酚微囊的最佳條件為芯壁比1∶5、壁材比11∶39、壁材濃度0.0208 g/mL。

表5 百里香酚微囊制備的正交試驗結(jié)果

表6 百里香酚微囊的方差分析

2.4 百里香酚微囊的驗證試驗結(jié)果

以最優(yōu)工藝A1B2C1為條件進行驗證性試驗,即平行制作三組樣品,進行三次重復試驗,對樣品的產(chǎn)率、包埋率與綜合評分進行統(tǒng)計。結(jié)果如表7所示,最佳工藝參數(shù)為芯壁比1∶5,壁材比11∶39,壁材濃度0.0208 g/mL,攪拌速度450 r/min,溫度40 ℃,50%戊二醛1 mL。

表7 百里香酚微囊的驗證試驗結(jié)果

2.5 百里香酚微囊的質(zhì)量評價

2.5.1 百里香酚微囊的溶出度評價

如表8結(jié)果所示,百里香酚、百里香酚微囊、芯材和壁材混合物的累積溶出度隨著時間的延長而增加,但百里香酚、芯材和壁材混合物的累積溶出度都高于百里香酚微囊。因此,百里香酚微囊可以有效減小百里香酚的溶出、減緩釋藥速度、延長藥效時間。

表8 百里香酚的溶出度測定結(jié)果

2.5.2 百里香酚微囊的形態(tài)分布評價

將百里香酚微囊與阿拉伯膠、殼聚糖、芯材和壁材混合物、百里香酚進行形態(tài)對比(圖3-圖8),可發(fā)現(xiàn)并確定有新的物質(zhì)生成。如圖8所示,可觀察到百里香酚微囊的表面光滑、呈球狀。

圖3 殼聚糖的顯微鏡觀察結(jié)果

圖4 阿拉伯膠的顯微鏡觀察結(jié)果

圖5 百里香酚的顯微鏡觀察結(jié)果

圖6 芯材和壁材混合物的顯微鏡觀察結(jié)果

圖7 百里香酚微囊樣品1的顯微鏡觀察結(jié)果

圖8 百里香酚微囊樣品2的顯微鏡觀察結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗以包封率和收率為評價指標,通過百里香酚的特殊微囊包被處理技術(shù),以阿拉伯膠和殼聚糖為壁材、50 %戊二醛為固化劑,在40 ℃、450 r/min的條件下采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法,篩選出百里香酚微囊最佳的制備工藝為百里香酚與壁材比1∶5、殼聚糖與阿拉伯膠比11∶39、壁材濃度0.0208 g/mL。顯微鏡下觀察可見,百里香酚被成功包被,即形成百里香酚微囊。溶出度實驗表明,將藥物微囊化可以減緩藥物的釋放速度、延長藥效時間。本試驗數(shù)據(jù)對于植物精油微囊制劑應用于畜禽疾病防控領域具有重要的現(xiàn)實意義。