汪愛華，張小華，張飛忠，王雄，趙勇

高催乳素血癥（hyperprolactinemia，HPRL）是一種下丘腦-垂體軸生殖內(nèi)分泌紊亂綜合征，發(fā)病率較高，特點是血清催乳素（prolactin，PRL）水平明顯升高［1］。HPRL 的主要臨床癥狀包括溢乳、月經(jīng)失調(diào)、多毛，甚至不孕等［2］。目前臨床上多使用溴隱亭等藥物治療HPRL。溴隱亭雖然有一定的療效，但其引起的頭暈、惡心、嘔吐，對多巴胺受體激動劑耐藥等不良反應(yīng)也不容忽視［3］。因此，更加安全有效的治療對于HPRL 意義重大。據(jù)報道，麥芽提取物（malt extract，ME）可降低HPRL 大鼠腦垂體PRL 的表達(dá)［4］。垂體前葉細(xì)胞是機(jī)體的重要內(nèi)分泌腺細(xì)胞，關(guān)于ME對HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL分泌的影響鮮有報道。相關(guān)研究顯示，靶向多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）依賴性Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）/胱天蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease-1，Caspase-1）/白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）通路可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化［5］。而ME 能否通過調(diào)控DRD2 介導(dǎo)的NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路活化來影響HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL分泌尚不明確。本研究旨在探究ME 對HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL分泌的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量240～250 g，購自凱學(xué)生物科技（上海）有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2021-0002，所有動物實驗均獲得本院動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：21005026）。

1.2 主要試劑及儀器 ME（規(guī)格：100 g）購自北京普非生物公司；NLRP3 激活劑腺苷三磷酸（adenosine 5'-triphosphate，ATP）購自美國MCE 公司；鹽酸甲氧氯普胺購自上海金穗生物科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自上海樂賽生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海廣銳生物公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢益普生物公司；PRL 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海欽誠生物公司；兔源增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、DRD2、生長激素、PRL、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter，DAT）、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH 一抗及羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam 公司。TS2009 型光學(xué)顯微鏡購自河南云飛科技發(fā)展有限公司；SAF-680T 酶標(biāo)儀購自上海巴玖實業(yè)有限公司；CytoFLEX S流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；DYCZ-24DH 型雙板垂直電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 HPRL大鼠模型的構(gòu)建 按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只大鼠，通過皮下注射100 mg/kg 鹽酸甲氧氯普胺注射液，每日1次，持續(xù)5 d 的方式構(gòu)建HPRL 大鼠模型［6］。若大鼠出現(xiàn)倦怠、呼吸急促、易怒等癥狀，且血清PRL 水平異常升高時，認(rèn)為造模成功，造模成功的大鼠設(shè)為HPRL 組。剩余的6 只大鼠設(shè)為對照組，皮下注射等體積生理鹽水。

1.4 大鼠垂體前葉細(xì)胞的分離 分別從對照組和HPRL 組大鼠中分離垂體前葉細(xì)胞。具體步驟：將大鼠麻醉處死后，取下大腦，無菌分離垂體前葉并放在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，用剪刀將其剪成1 mm3碎塊，加入膠原酶和DNA 酶Ⅰ，在常溫水浴下消化1 h，棄上清液，用培養(yǎng)液洗滌2 次后再用含20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞［7］。將從對照組大鼠中分離出的垂體前葉細(xì)胞命名為NC組，從HPRL組中分離的垂體前葉細(xì)胞命名為Model組。

1.5 大鼠垂體前葉細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色鑒定 將專用圓形蓋玻片放入24 孔板中，加入密度為1×104個/mL 的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)70%時，加入生長激素、PRL 一抗，4 ℃下孵育過夜，再加入二抗工作液孵育30 min，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，陰性對照用磷酸鹽緩沖液替代一抗進(jìn)行孵育，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠垂體前葉細(xì)胞中生長激素、PRL表達(dá)情況。

1.6 大鼠垂體前葉細(xì)胞的處理 根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，將Model 組大鼠垂體前葉細(xì)胞分別用0、25、50、100 mg/L ME，5 mmol/L ATP［8］，100 mg/L ME+5 mmol/L ATP 處理48 h，依次命名為空白組（Blank 組）、ME 低劑量組（ME-L 組）、ME 中劑量組（ME-M 組）、ME 高劑量組（ME-H 組）、ATP 組、ME-H+ATP組，處理結(jié)束后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 垂體前葉細(xì)胞形態(tài)的觀察 細(xì)胞分組處理48 h后再用結(jié)晶紫染色20 min，光學(xué)顯微鏡下觀察各組垂體前葉細(xì)胞形態(tài)。

1.7.2 CCK-8 法檢測垂體前葉細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種在96 孔板中，培養(yǎng)48 h 后，將10 μL CCK-8 試劑加入每個孔中并孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD450）值。

1.7.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測垂體前葉細(xì)胞凋亡 將各組垂體前葉細(xì)胞稀釋至密度為1×106個/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入離心管中，向其中加入5μL Annexin V-FITC 試劑室溫避光孵育10 min，再向離心管中加入5 μL PI 試劑，避光孵育5 min，最后加入PBS 使溶液終體積達(dá)到500μL。利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7.4 ELISA 法檢測垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL 水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL水平。

1.7.5 Western blot檢測垂體前葉細(xì)胞中DRD2、DAT、PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液提取大鼠垂體前葉細(xì)胞總蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)定量、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜與一抗DRD2（1∶2 000）、DAT（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、NLRP3（1∶2 000）、Caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜，然后與二抗（1∶1 000）在37 ℃下孵育1 h。加入ECL 試劑檢測蛋白質(zhì)印跡。Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠垂體前葉細(xì)胞的鑒定 陰性對照細(xì)胞胞質(zhì)有少量陽性顆粒，胞核呈藍(lán)色；生長激素陽性顆粒存在于所有大鼠垂體前葉細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)染色深，呈深棕褐色；PRL 陽性顆粒存在于所有大鼠垂體前葉細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)著色稍淺，呈淺棕褐色。分離培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細(xì)胞能正常分泌生長激素和PRL。NC 組、Model 組分離細(xì)胞即為大鼠垂體前葉細(xì)胞，見圖1。

Fig.1 Immunohistochemical identification of growth hormone and PRL secreted by anterior pituitary cells of rats(×200)圖1 免疫組織化學(xué)鑒定大鼠垂體前葉細(xì)胞中生長激素和PRL的表達(dá)（×200）

2.2 ME 對各組垂體前葉細(xì)胞形態(tài)的影響 NC 組垂體前葉細(xì)胞形狀規(guī)則；Blank組垂體前葉細(xì)胞體積變小，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核固縮；與Blank 組比較，ME-L 組、ME-M 組、ME-H 組垂體前葉細(xì)胞形態(tài)有所改善，而ATP組垂體前葉細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則；與ME-H 組比較，ME-H+ATP 組垂體前葉細(xì)胞體積及形狀不規(guī)則，見圖2。

Fig.2 Morphological comparison of anterior pituitary cells of rats between different groups(crystal violet staining,×200)圖2 各組大鼠垂體前葉細(xì)胞形態(tài)比較（結(jié)晶紫染色，×200）

2.3 ME對各組大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，Blank組垂體前葉細(xì)胞OD450值升高（P＜0.05）；與Blank組比較，ME-L組、ME-M組、ME-H組大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值降低，且呈劑量依賴性，而ATP 組大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值升高（P＜0.05）；與ME-H 組比較，ME-H+ATP 組大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of OD450 value,apoptosis rate and PRL level of anterior pituitary cells of HPRL rats between different groups表1 各組HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值、細(xì)胞凋亡率、PRL水平比較 （n=6，）

Tab.1 Comparison of OD450 value,apoptosis rate and PRL level of anterior pituitary cells of HPRL rats between different groups表1 各組HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值、細(xì)胞凋亡率、PRL水平比較 （n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NC 組比較，b與Blank 組比較，c與ME-L組比較，d與ME-M組比較，e與ME-H組比較，P＜0.05。表2、3同。

組別NC組Blank組ME-L組ME-M組ME-H組ATP組ME-H+ATP組F OD450值0.39±0.03 1.18±0.11a 0.95±0.08b 0.74±0.05bc 0.45±0.04bcd 1.44±0.12b 0.81±0.07e 139.400＊＊細(xì)胞凋亡率（%）12.64±0.31 4.05±0.10a 6.21±0.11b 8.36±0.12bc 11.12±0.13bcd 1.59±0.08b 7.34±0.16e 3 416.000＊＊PRL（mg/L）193.36±4.12 368.82±7.11a 321.26±5.79b 280.65±5.33bc 221.27±4.34bcd 473.54±8.32b 305.56±6.71e 1 405.000＊＊

2.4 ME 對各組垂體前葉細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，Blank 組垂體前葉細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與Blank組比較，ME-L組、ME-M組、ME-H組垂體前葉細(xì)胞凋亡率升高，且呈劑量依賴性，而ATP組垂體前葉細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與ME-H組比較，ME-H+ATP 組垂體前葉細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖3、表1。

Fig.3 Apoptosis of anterior pituitary cells in each group detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組垂體前葉細(xì)胞凋亡

2.5 ME對各組垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL水平的影響 與NC 組比較，Blank 組垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL 水平升高（P＜0.05）；與Blank 組比較，ME-L組、ME-M 組、ME-H 組大鼠垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL水平降低，且呈劑量依賴性，而ATP組大鼠垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL水平升高（P＜0.05）；與MEH 組比較，ME-H+ATP 組大鼠垂體前葉細(xì)胞上清液中PRL水平升高（P＜0.05），見表1。

2.6 ME 對各組垂體前葉細(xì)胞多巴胺表達(dá)的影響 與NC 組比較，Blank 組垂體前葉細(xì)胞中DRD2蛋白表達(dá)降低，DAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與Blank 組比較，ME-L、M、H組垂體前葉細(xì)胞中DRD2蛋白表達(dá)升高，DAT 蛋白表達(dá)降低，且呈劑量依賴性，而ATP組垂體前葉細(xì)胞中DRD2蛋白表達(dá)降低，DAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與ME-H 組比較，ME-H+ATP 組垂體前葉細(xì)胞中DRD2 蛋白表達(dá)降低，DAT蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4、表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of DRD2 and DAT proteins in anterior pituitary cells of rats in each group表2 各組大鼠垂體前葉細(xì)胞中DRD2、DAT蛋白表達(dá)的比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of expression levels of DRD2 and DAT proteins in anterior pituitary cells of rats in each group表2 各組大鼠垂體前葉細(xì)胞中DRD2、DAT蛋白表達(dá)的比較（n=6，）

組別NC組Blank組ME-L組ME-M組ME-H組ATP組ME-H+ATP組F DRD2 0.83±0.07 0.27±0.02a 0.39±0.03b 0.51±0.04bc 0.75±0.06bcd 0.11±0.01b 0.43±0.03e 218.600＊＊DAT 0.54±0.04 1.26±0.11a 1.07±0.09b 0.83±0.07bc 0.67±0.05bcd 1.62±0.13b 0.92±0.06e 114.300＊＊

Fig.4 Western blot analysis of DRD2 and DAT protein expression in rat anterior pituitary cells圖4 Western blot檢測大鼠垂體前葉細(xì)胞中DRD2、DAT蛋白表達(dá)

2.7 ME 對各組垂體前葉細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白及NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC 組比較，Blank 組大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與Blank組比較，ME-L組、ME-M組、ME-H組大鼠垂體前葉細(xì)胞中的PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)降低，且呈劑量依賴性，而ATP組大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與ME-H 組比較，ME-H+ATP 組大鼠垂體前葉細(xì)胞中的PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖5、表3。

Tab.3 Comparison of expression levels of PCNA,NLRP3,Caspase-1,IL-1β in anterior pituitary cells of each group表3 各組大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of expression levels of PCNA,NLRP3,Caspase-1,IL-1β in anterior pituitary cells of each group表3 各組大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

組別NC組Blank組ME-L組ME-M組ME-H組ATP組ME-H+ATP組F PCNA 0.27±0.02 0.88±0.07a 0.73±0.06b 0.55±0.05bc 0.36±0.02bcd 1.28±0.11b 0.63±0.05e 183.500＊＊NLRP3 0.58±0.04 1.57±0.12a 1.32±0.10b 1.11±0.09bc 0.73±0.06bcd 1.82±0.13b 1.20±0.11e 120.500＊＊Caspase-1 0.38±0.03 1.42±0.11a 1.24±0.12b 1.01±0.08bc 0.54±0.04bcd 1.68±0.12b 1.12±0.13e 134.900＊＊IL-1β 0.15±0.01 1.23±0.11a 1.06±0.11b 0.83±0.09bc 0.32±0.03bcd 1.58±0.11b 1.20±0.13e 178.700＊＊

Fig.5 Western blot analysis of PCNA,NLRP3,Caspase-1,IL-1β in rat anterior pituitary cells圖5 Western blot檢測大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)

3 討論

垂體前葉是由多種內(nèi)分泌細(xì)胞組成，其可以合成和分泌多種類型的激素，從而協(xié)調(diào)多項生理功能，包括生長、新陳代謝、應(yīng)激反應(yīng)、生殖和哺乳，如泌乳細(xì)胞分泌PRL［9］。適當(dāng)?shù)腜RL 對于維持生殖功能、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、代謝穩(wěn)態(tài)和胰腺胰島素分泌十分重要，而PRL 水平過高易引起HPRL 等多種疾?。?0］。在正常情況下，大鼠垂體前葉細(xì)胞的增殖活性和PRL 水平較低［11］。本研究分離出正常大鼠和HPRL大鼠的垂體前葉，并經(jīng)剪碎、消化、培養(yǎng)等操作后，形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)染色證實成功得到NC組、Model 組大鼠垂體前葉細(xì)胞。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，Blank 組大鼠垂體前葉細(xì)胞OD450值、上清液中PRL 水平升高，細(xì)胞凋亡率降低，表明HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖活性及PRL 水平異常升高。PCNA 作為常用于衡量細(xì)胞增殖能力的常用指標(biāo)，其水平越高，表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)［12］。Blank組大鼠垂體前葉細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平高于NC組，再次證實了HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖能力異常增強(qiáng)。PRL 在正常情況下是被限制釋放的，且由多巴胺介導(dǎo)，多巴胺可作用于細(xì)胞表面的DRD2，進(jìn)而抑制PRL 的分泌［13］。DAT 是特異性表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元的蛋白，其水平升高，可使多巴胺濃度降低，進(jìn)而促進(jìn)PRL 的分泌［14］。本研究結(jié)果顯示，與NC 組比較，Blank 組垂體前葉細(xì)胞中DRD2 蛋白表達(dá)降低，DAT 蛋白表達(dá)升高，提示Blank 組垂體前葉細(xì)胞多巴胺表達(dá)受到抑制。

ME 中含有一定量的黃酮和多糖，已有研究顯示，ME 能明顯降低甲氧氯普胺誘導(dǎo)HPRL 小鼠的PRL水平［15］；ME對實驗性HPRL具有良好的治療效果［16］。而關(guān)于ME 對HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL分泌的影響鮮有報道。本研究顯示，ME可抑制HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL 分泌，且呈劑量依賴性，提示ME 有可能成為治療HPRL 的藥物。

DRD2 已被視為HPRL 治療中的潛在靶點［17］。在ATP、活性氧、溶酶體內(nèi)容物或其他因素的刺激下，NLRP3 募集銜接分子凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和Caspase-1 前體以促進(jìn)Caspase-1 活化，這個過程導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)［18］。近年來多項研究表明，DRD2 介導(dǎo)的NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路參與多種疾病的進(jìn)展，如DRD2 通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路的激活，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥的進(jìn)展［19］。本研究亦證實ME 可以上調(diào)HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞中DRD2 蛋白表達(dá)，而ME能否調(diào)控NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路影響HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL分泌尚不明確。本研究結(jié)果顯示，ME可抑制HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)，推測ME可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路進(jìn)而抑制HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL 分泌。為了驗證該推測，本研究在高劑量ME 作用的基礎(chǔ)上再用NLRP3 激活劑ATP 干預(yù)HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞，結(jié)果顯示，ATP減弱了高劑量ME對HPRL大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖與PRL 分泌的抑制作用，證實了ME可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路進(jìn)而抑制HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL 分泌。然而，本研究未在高劑量ME 作用的基礎(chǔ)上再設(shè)置DRD2 的阻斷劑來干預(yù)HPRL 大鼠，進(jìn)而驗證ME 對NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路的抑制作用是否是通過DRD2來介導(dǎo)的，這是本研究的不足之處。

綜上所述，ME可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路進(jìn)而抑制HPRL 大鼠垂體前葉細(xì)胞增殖及PRL 分泌。然而本研究僅僅進(jìn)行了體外研究，有待體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。