葉潔忺 張靜 張子霖 沙利烽 葛健軍 陳早早 張娟 顧忠澤
關(guān)鍵詞:化妝品;微流控技術(shù);生物傳感器;皮膚芯片;安全性;功效性
01前言
隨著科技的發(fā)展以及人們對化妝品需求的增加,成分更復(fù)雜、功能更多樣化的化妝品應(yīng)運而生,檢驗化妝品安全性、功效性的重要性不言而喻。歐盟消費者安全科學(xué)委員會(SCCS) 在《化妝品成分測試及其安全性評估指南注釋》中提出了化妝品成分和產(chǎn)品的安全性評估,要求包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏、皮膚吸收、慢性毒性等多項研究[1]。
微流控技術(shù)是一項綜合性很強(qiáng)的多學(xué)科技術(shù),具有在微米尺度上對流體進(jìn)行精確控制和操縱的能力[2],與傳統(tǒng)基于實驗室的宏觀技術(shù)相比,其優(yōu)勢在于樣本量小、高通量、低成本、高靈敏度。通過微流控技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)、組織工程技術(shù)、生物傳感技術(shù)的融合,其在化妝品安全與功效評價中的應(yīng)用潛力不容忽視。
02理化檢測應(yīng)用
生物傳感器是一種將生物識別元件和生物材料與物理傳感器結(jié)合來轉(zhuǎn)換生物反應(yīng),以產(chǎn)生可測量信號的分析裝置,微流控裝置具有可移動性、操作透明性、可控性、準(zhǔn)確性等優(yōu)點[3,4]。結(jié)合微流體技術(shù)的生物傳感器可以實現(xiàn)更快的處理和更高的效率,它們在化妝品檢測中發(fā)揮著重要作用,如化妝品的有毒元素檢測、活性物質(zhì)檢測等[5]。
2.1 重金屬檢測
在化妝品中,為了達(dá)到美白效果,經(jīng)常添加汞,一旦過量,就會對皮膚和器官造成慢性毒性[6]。Chao Wu 等人[7] 開發(fā)了一種簡單、快速和可視化的Hg2+ 檢測策略。當(dāng)Hg2+存在時,探針可以轉(zhuǎn)化為G- 四聯(lián)體DNA,并與血紅蛋白結(jié)合形成DNA 酶,DNA 酶與沉淀的TMB 反應(yīng),在紙上產(chǎn)生可見的色帶,色帶長度與Hg2+ 濃度呈正相關(guān)。該傳感器不僅能檢測汞離子,并具有良好的再現(xiàn)性和滿意的動態(tài)范圍,檢出限低至0.23 nM。該方法不僅提供了Hg2+ 的可視化快速篩查,而且可應(yīng)用于其他金屬離子的即時檢測。
2.2 微生物檢測
化妝品微生物指標(biāo)檢測化妝品微生物污染是社會關(guān)注的熱點問題。被污染的微生物可能產(chǎn)生一些代謝物,刺激皮膚炎癥或過敏反應(yīng)。因此,規(guī)范有效的化妝品質(zhì)量監(jiān)督管理十分重要[5]。
Peng Zuo 等人[8] 發(fā)明了一種聚二甲基硅氧烷(PDMS)/ 紙/ 玻璃混合微流控系統(tǒng),該系統(tǒng)基于集成的適配體功能化氧化石墨烯生物傳感器,無需樣本制備程序,可直接檢測病原微生物。該微流體生物傳感器裝置只需10 分鐘即可完成金黃色葡萄球菌的檢測,相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,大大縮短檢測周期,并且在快速檢測各種不同的其他細(xì)菌和病毒病原體方面具有很大的潛力。
2.3 抗生素檢測
化妝品中的抗生素主要有甲硝唑、氯霉素、氧氟沙星等,能抑制皮膚微生物,增強(qiáng)皮膚抵抗細(xì)菌感染的能力,達(dá)到表面保護(hù)皮膚的效果。但長期使用含抗生素的化妝品會引起接觸性皮炎等不良反應(yīng),如紅斑、水腫、滲出、灼燒等,還會導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素的耐藥性增加,降低治療效果[9,10]。
André Kling[11] 等人構(gòu)建了一個可在臨床相關(guān)樣品中同時進(jìn)行多重分析的電化學(xué)檢測的微流控平臺,能實現(xiàn)不同酶聯(lián)分析的同時電化學(xué)讀數(shù),檢測八種不同的分析物。該裝置可在15 分鐘內(nèi)使用高靈敏度的生物分子傳感器系統(tǒng),同時完成樣本中四環(huán)素和鏈球菌素這兩種常用抗生素的檢測。
03體外皮膚模型
2019 年,美國環(huán)境保護(hù)局正式宣布從2035 年起不再支持使用哺乳動物實驗進(jìn)行安全性測試的研究[12]。基于相關(guān)法律法規(guī)的頒布和大家對“3R” 原則(reduction,replacement, refinement) 的關(guān)注,建立穩(wěn)定的體外皮膚模型以減少化妝品行業(yè)中傳統(tǒng)的動物實驗十分必要。
體外皮膚模型自20 世紀(jì)40 年代起開始大力發(fā)展。1948 年,首次出現(xiàn)對體外培養(yǎng)成年哺乳動物皮膚上皮的描述;1975 年,使用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的2D 皮膚模型出現(xiàn);1976 年,第一個體外3D 皮膚模型出現(xiàn),它更加接近了皮膚的自然結(jié)構(gòu)和功能;隨后出現(xiàn)了更多不同類型的人類皮膚等效物[13–19]。直至今日,已經(jīng)發(fā)展出多種可用于化妝品安全性和功效性評價的功能化皮膚模型,其在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用前景十分廣闊。
3.1 皮膚芯片
皮膚芯片(skin-on-a-chip) 是在微流控體系中培養(yǎng)皮膚組織,通過控制大量物理、生物化學(xué)參數(shù)如培養(yǎng)基流動、機(jī)械力、生物化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度等模擬真實人體皮膚的三維培養(yǎng)微環(huán)境,從而制造具有皮膚層級結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)的功能化的三維皮膚組織[20]。微流控設(shè)備的主要優(yōu)點是流體流動和對微環(huán)境的精細(xì)控制,與靜態(tài)培養(yǎng)相比,微流控系統(tǒng)可以精確控制各種參數(shù),如機(jī)械力、介質(zhì)流量和生物化學(xué)的梯度,改善細(xì)胞分化、形態(tài)、功能、細(xì)胞- 細(xì)胞和細(xì)胞- 基質(zhì)相互作用,在皮膚芯片中集成成熟皮膚層和皮膚附屬器官,且使其具有屏障功能[21–23]。
典型的皮膚芯片包括一個transwell 支架或一層多孔膜,將皮膚模型與底層灌注的培養(yǎng)基分開,允許藥物或細(xì)胞因子等大分子擴(kuò)散到皮膚模型中[24]。皮膚組織通常是由原代來源分離的細(xì)胞、干細(xì)胞分化的皮膚細(xì)胞或從活檢組織中獲得的皮膚所制造的[24]。主要相關(guān)細(xì)胞有角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,也包括內(nèi)皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、免疫細(xì)胞等其他細(xì)胞,以及部分附屬器官,例如血管、毛囊等[25,26]。
皮膚芯片應(yīng)用于化妝品行業(yè)的優(yōu)勢不僅在于其更加還原人體真實皮膚結(jié)構(gòu),還能進(jìn)行形態(tài)、活性、生化指標(biāo)以及屏障功能、滲透性等皮膚特定功能檢測,并支持在芯片上集成多種原位生物傳感器,以提供更豐富的功能,如實時皮膚功能檢測和藥物動力學(xué)反應(yīng)[27]。
3.2 安全性評估
在新的化妝品成分投放市場之前,需要對其安全性進(jìn)行多方面評估,包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏等,皮膚芯片在安全性評估中主要用于皮膚致敏和皮膚刺激試驗的毒理學(xué)評價。
3.2.1 毒理學(xué)評估
Jong Seung Lee 等人[28] 報道了一種能夠?qū)λ幬锖突瘖y品化合物進(jìn)行詳細(xì)毒理學(xué)評估的混合人體皮膚芯片( 見圖1a)。該研究構(gòu)建的皮膚—神經(jīng)和皮膚—肝臟混合模型可以與代表性的分析方法相結(jié)合,如鈣成像檢測神經(jīng)元活性、GSH/ROS 檢測肝毒性,以進(jìn)行實時定量皮膚致敏分析和皮膚施用化學(xué)物質(zhì)的潛在肝毒性評估,有助于定量評估皮膚施用化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)效應(yīng)。
3.2.2 化學(xué)刺激評估
Jing Zhang 等人[29] 構(gòu)建了一種直接在微流控芯片內(nèi)培養(yǎng)和分化人類角質(zhì)形成細(xì)胞的高仿真表皮芯片(見圖1b), 主要通過細(xì)胞毒性對10 種已知毒素和非毒素的化學(xué)品進(jìn)行體外刺激評價,且對刺激反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步評估,如炎癥細(xì)胞因子釋放等。檢測結(jié)果表明,該皮膚芯片是體外皮膚刺激評估的潛在替代方案。同時,該系統(tǒng)還集成了TEER 傳感器,可為后續(xù)檢測提供便利。
3.3 功效評價
3.3.1 有效成分篩選
在開發(fā)化妝品的過程中,需要花費大量時間用于篩選有效活性成分及其組合。Zhengkun Chen 等人[30] 構(gòu)建了一個在仿生和動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中生長大量真皮成纖維細(xì)胞球體(dermal fibroblast sphere,DFS)的微流控平臺(見圖2)。該團(tuán)隊先在芯片上培養(yǎng)形成DFS,再探究不同劑量的維生素C 對DFS 生產(chǎn)I 型膠原蛋白和纖維連接蛋白的影響,實現(xiàn)在3 天內(nèi)高效篩選維生素C 對蛋白質(zhì)合成的影響。概念驗證設(shè)計中,可以在單個芯片上實現(xiàn)12 種不同的成分或成分組合的高通量篩選,大大提高有效成分篩選的工作效率,縮短化妝品研發(fā)周期。
3.3.2 透皮吸收評價
在化妝品開發(fā)的過程中,化妝品通過皮膚屏障的滲透能力十分關(guān)鍵,需要對化妝品及其活性成分進(jìn)行透皮吸收進(jìn)行測試。相比于傳統(tǒng)的Franz 細(xì)胞擴(kuò)散法,使用皮膚芯片檢測不僅能規(guī)避倫理問題和物種差異,也能更好地模擬皮膚微循環(huán),得到更有效的數(shù)據(jù)。
Gopu Sriram 等人[31] 設(shè)計了一種用于全層人體皮膚的集成培養(yǎng)和測試的新型微流控裝置(見圖3a)。皮膚模型可以直接在設(shè)備中重建,并支持對其進(jìn)行滲透和毒性研究。通過TEER 評價了皮膚組織的完整性,并通過滲透性實驗比較了化合物咖啡因在皮膚芯片模型和靜態(tài)皮膚模型中的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)運。實驗證明,該裝置能顯著提高皮膚模型的質(zhì)量和功能,并具有在同一平臺上進(jìn)行皮膚安全和滲透測試等下游檢測的優(yōu)勢( 見圖3b)。
Varga-Medveczk 等人[32] 所開發(fā)的微流控擴(kuò)散室(Microfluidic Diffusion Chamber,MDC) 可用于局部化妝品經(jīng)皮吸收的體外/ 離體監(jiān)測,并可根據(jù)具體實驗需求進(jìn)行部分改裝。在驗證試驗中,將含咖啡因的乳膏放置在微芯片供體隔室中,并使用外周灌注,將人工皮膚中與人體皮膚中的咖啡因轉(zhuǎn)運進(jìn)行比較,結(jié)果顯示出相似的轉(zhuǎn)運動力學(xué)和良好的再現(xiàn)性。另外還研究了兩種p 糖蛋白底物紅霉素和奎尼丁在p 糖蛋白抑制劑PSC-833 存在和不存在情況下的透皮滲透曲線。以上實驗表明,MDC 系統(tǒng)可用于研究皮膚芯片微流控系統(tǒng)與透皮成分傳遞和真皮屏障轉(zhuǎn)運蛋白之間的相互作用,在化妝品透皮吸收評價中很有應(yīng)用價值。
3.3.3 抗衰評價
體內(nèi)衰老是由人體的代謝過程所引起的,外表老化與長期暴露于紫外線及其他環(huán)境因素有關(guān)[33]。人們期望使用化妝品達(dá)到預(yù)防或逆轉(zhuǎn)皮膚老化的效果,以保持年輕健康的皮膚外觀。因此有很多關(guān)于皮膚老化及抗衰老的研究正在不斷開展[34,35]。
Subin Jeong 等人[36] 基于具有人類成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的全層三維皮膚的柔性皮膚芯片,使用光交聯(lián)劑和反映晝夜節(jié)律的機(jī)械刺激環(huán)境開發(fā)老化皮膚模型(見圖4a,b)。在28 天的比較培養(yǎng)中,該模型全層皮膚當(dāng)量收縮減少,表皮層厚度減少,β- 半乳糖苷酶基因表達(dá)增加,記錄并證明了衰老的過程。這種新型芯片皮膚衰老模型的使用有望揭示新的衰老機(jī)制,可用于新的抗衰老物質(zhì)的篩選和功效測試,對抗衰老化妝品的開發(fā)具有重要意義。
Gun Yongo Sung[37] 等人利用其所在團(tuán)隊開發(fā)的基于無泵PDMS 芯片系統(tǒng)的全層皮膚芯片( 見圖4c),檢測姜黃葉提取物(CLLE) 作為一種化妝品原料對皮膚抗衰老的作用,結(jié)果顯示50 μg/mL 的CLLE 作用后能顯著增強(qiáng)皮膚模型的屏障功能,并且從基因、蛋白水平均顯示絲聚蛋白、內(nèi)批蛋白的表達(dá)增高。此研究表明,該無泵皮膚芯片模型可以作為動物研究的替代方案用于化妝品行業(yè)。
3.3.4 美白測試
黑色素的過度表達(dá)可導(dǎo)致黃褐斑等皮膚疾病,色素沉著問題也是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一[38]。出于對美容和健康的雙重考慮,人們對美白化妝品的需求逐步增加,檢測化妝品的美白功效也成為產(chǎn)品開發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。
Qiwei Li 等人[39] 設(shè)計了一種可進(jìn)行半固體、固體物質(zhì)測試的三單元表皮芯片( 見圖5a)。在芯片中培養(yǎng)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和正常人黑素細(xì)胞后,生成的穩(wěn)定黑色素表皮呈現(xiàn)出多層結(jié)構(gòu),并具有屏障功能。該團(tuán)隊使用此表皮芯片測試了一種化妝品的美白效果,通過表征與分析證明了該化妝品在減少黑色素合成方面的功效( 見圖5b)。同時還使用該表皮芯片測試了四種化學(xué)物質(zhì)的刺激和滲透特性。測試結(jié)果表明,該皮膚芯片可以為皮膚刺激或滲透的體外評估以及美容評估提供一種替代方法。
04總結(jié)與展望
隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展,其在化妝品安全與功效評價中的應(yīng)用也更加豐富多樣。微流控技術(shù)和生物傳感器的結(jié)合可以實現(xiàn)對化妝品中的重金屬、微生物、抗生素進(jìn)行快速檢測,大大提高了檢測特異性、靈敏度,進(jìn)一步縮短了檢測時間。但目前仍存在傳感器識別精度不夠準(zhǔn)確,穩(wěn)定性差,制備周期長等問題,還有待進(jìn)一步改進(jìn)。
此外,生物傳感器不能用于檢測化妝品中的所有物質(zhì),如防腐劑等。
皮膚芯片結(jié)合了微流控、微傳感、組織工程等多種技術(shù),能對真實人體皮膚進(jìn)行一定程度上的模仿,有望部分替代傳統(tǒng)動物試驗。雖然目前已經(jīng)出現(xiàn)多種皮膚芯片,但皮膚芯片真正商業(yè)化還面臨著各種難題,如細(xì)胞類型的缺失、皮膚附屬物的缺失、微血管的復(fù)制、皮膚表面微環(huán)境的構(gòu)建等等,故而還原人體皮膚的程度有限,仍需進(jìn)一步發(fā)展。2022 年12 月,我國第一個器官芯片國家標(biāo)準(zhǔn)《皮膚芯片通用技術(shù)要求》通過立項評審,將推進(jìn)該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展和行業(yè)規(guī)范化??傮w來說,皮膚芯片作為一項能集成多種原位生物傳感器、聯(lián)合多器官芯片的新興技術(shù),在實現(xiàn)多種化妝品評價方面的發(fā)展?jié)摿κ蔷薮蟮摹?/p>