張錚 陳瓊 李璐 蘇哲 王鋼力 涂家生 尚靖 孫春萌

關(guān)鍵詞：納米原料；歐盟消費者安全科學委員會；安全評估；法規(guī)；發(fā)展趨勢

納米原料憑借其獨特的尺寸、分散性以及抗氧化等各項優(yōu)勢，目前在化妝品行業(yè)的運用日益廣泛[1， 2]。尤其是納米二氧化鈦（TiO2） 和納米氧化鋅（ZnO），它們是如今市面上防曬霜產(chǎn)品中占比最大的兩種物理防曬劑。但正是由于納米原料優(yōu)異的尺寸以及表面性能，導致其在納米尺度下表現(xiàn)出與常規(guī)物料截然不同的性質(zhì)。例如高表面能、制劑穩(wěn)定性、皮膚暴露風險等一系列問題。因此納米原料的性質(zhì)及使用安全性始終受到國際各方面的高度關(guān)注[3， 4]。

其中，歐盟消費者安全科學委員會（ScientificCommittee on Consumer Cafety，SCCS） 在納米原料安全評估方面始終保持積極態(tài)度。SCCS 于2019 年發(fā)布一項《化妝品納米原料安全評價指南》（SCCS/1611/19）[5]，提出以暴露為導向的安全評估策略，采用與常規(guī)物質(zhì)（非納米） 相同的原則進行。針對化妝品納米原料，國際化妝品監(jiān)管合作組織（International Cooperation on CosmeticsRegulation， ICCR） 也持續(xù)成立專項工作組，就相關(guān)問題組織多項專題討論與研究，并發(fā)布一系列技術(shù)性文件[6]。

01納米原料的安全性評估現(xiàn)狀

在2019 年最新發(fā)布的《化妝品納米原料安全性評價指南》[5] 中，SCCS 對化妝品中納米原料的安全性評估方法進行了新階段的討論。它不僅是對于納米原料相關(guān)領(lǐng)域最新研究成果的更新，還新增了有關(guān)、涂層、載體、免疫毒性等新型風險評估模式的討論。而ICCR 對化妝品納米原料的安全性評估方法也進行了相關(guān)討論[7]。與SCCS 類似，它也是提出一項以暴露為導向的安全評估策略，采用與常規(guī)物質(zhì)（非納米） 相同的原則進行，逐一討論納米原料的一般安全性、理化特征、暴露風險評估、危害識別和特征描述以及風險描述。

1.1 暴露風險評價

在所有納米粒子的體內(nèi)/ 外透皮性能研究中報道最多的要數(shù)物理防曬劑納米TiO2 和ZnO。實際上，早在2000 年歐盟化妝品和非食品科學委員會（ScientificCommittee on Cosmetic and Non-food Products，SCCNFP）就已經(jīng)發(fā)布了一份有關(guān)納米TiO2 的意見書[8]，其中總結(jié)了100 多項有關(guān)體外（人、豬皮）或體內(nèi)（大鼠、人體皮膚活檢） 研究結(jié)果。絕大多數(shù)實驗結(jié)果表明，微米或納米尺寸的TiO2 顆粒僅能滯留在皮膚表面或角質(zhì)層（SC） 外層，并不會滲透進入活性皮膚中，甚至穿透人體皮膚產(chǎn)生全身暴露風險[9]。為此SCCNFP 于同年通過了有關(guān)納米TiO2 最高可添加25% 作為化妝品中的紫外線過濾劑的安全性意見。

1.1.1 經(jīng)皮暴露途徑

由于這項科學意見牽涉化妝品中物理防曬劑的使用，不久后SCCS 就開展專項審查工作，考察異常皮膚狀況（如SC 剝離、UVB 損傷、炎癥皮膚） 對納米TiO2 皮膚滲透性能的影響。Senzui 等[10] 考察了四種不同類型的納米TiO2分別對尤卡坦小型豬完整、SC 剝離和脫毛皮膚的體外滲透性能。實驗結(jié)果顯示，在完整和SC 剝離的皮膚中，無論納米TiO2 是何種類型，均未觀察到皮膚滲透現(xiàn)象。

Monteiro 等[11] 利用紫外線對約克郡豬進行照射，從而獲得UVB 損傷皮膚模型。隨后對自制含納米TiO2、ZnO 的防曬霜進行體內(nèi)/ 外經(jīng)皮滲透性能的考察。體外透皮實驗TEM 掃描結(jié)果顯示，TiO2 粒子最多穿透至SC 第17 層，而ZnO 則停留在皮膚的表面。通過ICP-MS 分析接收液，并未檢測到有任何Ti、Zn 元素，證明并沒有納米粒子穿透皮膚屏障。體內(nèi)透皮實驗結(jié)果也與體外保持一致，通過SEM 電鏡觀察到納米粒子大多以團聚物的形式滯留在皮膚表面和毛囊的根部。整體來說，納米TiO2 和ZnO對于UVB 損傷皮膚的滲透性能略微增強，但是目前還沒有觀察到有透皮吸收的風險。

諸如上述對于納米TiO2、ZnO 的透皮性能考察不勝枚舉，幾乎所有在人類/ 動物中進行的體外或體內(nèi)透皮研究均表明，納米TiO2 的滲透強度僅局限于SC，在皮膚中的暴露量十分有限。于是SCCS 在2014 年發(fā)布關(guān)于納米TiO2 的安全性評估[12] 并得出結(jié)論：目前已有的實驗證據(jù)表明，Ti O2 納米顆粒的透皮吸收性能較差，使用濃度高達25% 的納米TiO2 作為防曬霜中的紫外線過濾器也不會對人類（健康、完整或曬傷的皮膚） 造成任何不良影響。

1.1.2 吸入暴露途徑

雖然市面上大部分防曬霜和其他提供紫外線防護的化妝品都是通過直接涂抹皮膚來使用的。但還有部分產(chǎn)品以噴涂方式應用，這就可能導致消費者肺部發(fā)生納米TiO2 的吸入暴露風險[13]。

Eydner 等[14] 使用納米TiO2 對雌性Wistar 大鼠進行了為期3 周的體內(nèi)吸入研究。通過組織病理學檢測，觀察到大鼠肺部發(fā)生了細微的炎癥變化。雖然通過相對沉積指數(shù)（RDI） 的計算發(fā)現(xiàn)，在毛細血管中存在少量的納米顆粒，但是并沒有觀察到明顯的血液易位行為。在其他幾項有關(guān)吸入暴露納米TiO2 的毒代動力學研究中[15， 16]，納米TiO2 確實存在穿透肺屏障發(fā)生易位的情況，在肝臟、心臟、腎臟、胰腺、脾臟、腦或血液中均檢測出了納米顆粒，但是易位程度和易位量十分有限，畢竟易位速率明顯比肺清除速率更慢。

由于SCCS 的意見只涉及納米TiO2 的皮膚應用，于是又另外發(fā)布了一則聲明：不建議將納米TiO2 以噴霧制劑的形式應用到化妝品中，它可能會導致肺部發(fā)生吸入暴露風險[13]。根據(jù)這一意見，歐盟化妝品法規(guī)規(guī)定最高添加25% 的納米TiO2 作為紫外線過濾器，噴霧產(chǎn)品除外。

1.2 毒理學評價

通常情況下，傳統(tǒng)尺寸的納米TiO2 和ZnO 被認為是無害的。但是當它們的尺寸縮小到納米級別時，由于理化性質(zhì)、化學反應性和光催化活性的改變，納米顆粒與生物分子之間的相互作用可能會大幅增強[17]。大量實驗研究表明，Ti O2 納米顆粒固有細胞毒性的增加，主要是由氧化應激和細胞膜破壞所導致的[18]。另外，Watson[19] 通過彗星實驗考察了ZnO 納米顆粒對TK6/H9T3 的細胞毒性影響。研究結(jié)果表明，ZnO 粒子對兩種細胞系存在明顯的DNA 損傷和細胞毒性作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。其他有關(guān)納米TiO2 通過不同途徑發(fā)生暴露的毒性研究發(fā)現(xiàn)，暴露部位均產(chǎn)生了不同程度的病理損傷。如吸入暴露，肺部便會出現(xiàn)類似石棉引起間皮瘤樣的細胞損傷，進而可能導致肺部腫瘤[17]。

為此，歐洲化學品管理局（European ChemicalsAgency， ECHA） 于2017 年6 月9 日宣布：“現(xiàn)有科學證據(jù)符合分類、標簽和包裝法規(guī)（Classification Labeling andPackaging， CLP） 的標準，將鈦白粉（二氧化鈦或TiO2）列入懷疑通過吸入可能引起癌癥的物質(zhì)?！?同一時間段，美國化學學會（American Chemical Society， ACS） 也于同年3 月宣布[20]：“根據(jù)人類和動物的科學研究發(fā)現(xiàn)，納米顆?？梢詮姆尾窟M入血液，到達心血管系統(tǒng)的易感區(qū)域，在那里它們可能會增加心臟病發(fā)作或中風的可能性?！?澳大利亞政府與工業(yè)、創(chuàng)新、氣候變化、科學、研究和高等教育部均一致認為，納米顆粒的毒性可能比其他材料更大。

1.3 光毒理學評價

對于納米TiO2 和ZnO 這類紫外屏蔽劑來說，還存在另一個不容忽略的問題，即當暴露于紫外線輻射時，他們有可能會產(chǎn)生一類被稱為活性氧（ROS） 的自由基，包括羥基自由基、超氧化物陰離子和單線態(tài)氧等。眾所周知，這類自由基會導致各種各樣的氧化損傷[21]。Rampaul等[22] 通過亞甲基藍探究不同涂層的納米TiO2 和ZnO的光催化活性。研究表明，表面經(jīng)過有機硅烷或聚二甲基硅氧烷處理的TiO2 納米粒（銳鈦礦/ 金紅石混合晶型）具有極強的光催化活性，對MDCK-（1 犬腎上皮）、Pt K2（袋鼠腎上皮） 和HaCaT（人皮膚上皮） 細胞都變現(xiàn)出非常嚴重的細胞毒性。與空白組比較，死亡率增加了2 ～ 4.9 倍。相比之下，帶有氧化鋁或錳涂層的純金紅石型TiO2 顆粒要顯得更為安全，幾乎沒有發(fā)生光降解。另外值得注意的是，納米ZnO 自身也會產(chǎn)生一定的自由基，甚至在某些條件下，由于ZnO 的存在，TiO2 的光催化活性還會進一步提高。后來Tiano[23] 通過考察經(jīng)過表面修飾的TiO2顆粒在UVA 照射條件下對人體成纖維細胞的影響，進一步證實了上述結(jié)論。實驗結(jié)果顯示，純銳鈦礦型或與金紅石型混合的TiO2 顆粒，無論表面是否涂覆涂層，都具有高度的光催化活性。或許這就是包括防曬霜在內(nèi)的化妝品大多采用金紅石型的納米TiO2 的原因。

02納米原料的風險考量

2016 年，按照《歐盟化妝品法規(guī)1223/2009》[24]要求，歐盟公布了一項較為完整的市場上化妝品所用納米原料的目錄。由于存在大量不確定數(shù)據(jù)，因此不斷修訂，目前最新版本發(fā)布于2019 年11 月。該目錄中主要收錄了4 種納米原料用作化妝品中的防曬劑組分，分別是三聯(lián)苯基三嗪[25]、氧化鋅[26]、二氧化鈦[27] 和亞甲基雙- 苯并三唑基四甲基丁基酚[28]。

2.1 三聯(lián)苯基三嗪

根據(jù)SCCS 最新修訂的意見書（EU No.886/2014），將10% 的納米三聯(lián)苯基三嗪（初始粒徑≥ 80 nm，純度≥ 98%，無涂層） 作為化妝品中的防曬劑使用時，可認為其經(jīng)皮使用不存在風險性。但在進行風險評估時，考慮到存在吸入性暴露，且存在較多的不確定性導致無法得出10% 三聯(lián)苯基三嗪是否可以在噴霧產(chǎn)品安全使用。因此，SCCS 認為如果不能提供更多關(guān)于反復吸入后的安全性信息，則禁止將三聯(lián)苯基三嗪應用于噴霧類產(chǎn)品中。

2.2 氧化鋅

早在2003 年，化妝品及非食品類產(chǎn)品消費者科學委員會（Scientific Committee on Cosmetic Products andNon-food Products intended for Consumers， SCCPNP）就發(fā)表了關(guān)于ZnO 安全性的觀點。SCCPNP 認為：通常情況下，ZnO 被認為是一種非毒性物質(zhì)，包括用于化妝品時。但是，由于并沒有考慮ZnO 潛在的吸入暴露風險，后來的消費產(chǎn)品科學委員會（Scientific Committee forConsumer Products， SCCP） 又對微?；痁nO 的安全性提出擔憂。在SCCP 后續(xù)發(fā)表的觀點中，SCCP 認為非納米型ZnO 以25% 的最大濃度用于化妝品時是安全的，但對于納米型ZnO 的風險評估，仍需要提供進一步的數(shù)據(jù)支持。

因此，SCCS 又分別于2012 年、2013 年發(fā)表了關(guān)于納米ZnO 的安全評估觀點。SCCS 認為，基于現(xiàn)有的證據(jù)，特定條件的納米ZnO 以25% 的最大濃度、作為防曬劑施用于人體皮膚時，并不會引起不良反應。此外，SCCS 還認為沒有證據(jù)表明ZnO 納米顆粒能夠通過皮膚或口腔途徑吸收，且通過安全邊際（MoS） 計算所得的結(jié)果也是可以接受的。但是，根據(jù)現(xiàn)有信息，SCCS 認為ZnO 納米顆粒用于噴霧型產(chǎn)品是不安全的，其主要原因是潛在的吸入風險。

因此，基于上述SCCS 的觀點，歐盟委員會于2016年4 月21 日發(fā)布修訂法規(guī)（EU No.621/2016），認為納米ZnO 可以在化妝品中作為防曬劑使用，最大使用濃度為25%，但不得應用于吸入類型的產(chǎn)品中，以防消費者因吸入而導致肺部暴露風險。

2.3 二氧化鈦

2013 年7 月，SCCS 發(fā)布一項科學說明。當符合指定規(guī)格且使用濃度不超過25% 時，納米TiO2 作為防曬劑用于健康、完整或曬后皮膚時，并不會產(chǎn)生健康風險或不良反應。此外，考慮到并無系統(tǒng)性暴露，SCCS 認為通過皮膚使用納米TiO2 并不會給消費者帶來顯著風險。但是，SCCS 對于納米TiO2用于噴霧型產(chǎn)品的安全性感到擔憂，主要集中于可能通過吸入產(chǎn)生肺部暴露。

另外，SCCS 注意到納米原料顯著的光催化活性不僅會對暴露的皮膚產(chǎn)生局部影響，而且沉積在毛囊或汗腺中的光活性納米顆?？赡軙黹L期威脅。因此SCCS 明確指出“化妝品中使用的納米材料理想情況下應為非光催化材料”，并于2015 年發(fā)布了關(guān)于納米Ti O2 防曬霜配方的新指南[29]。六項關(guān)鍵性建議中有三項是針對TiO2 的材料本身：納米TiO2 主要由金紅石型或不超過5% 銳鈦礦的金紅石型組成；納米TiO2 在最終制劑中對光照穩(wěn)定；納米TiO2 不具有光催化活性。

根據(jù)上述SCCS 的意見，歐盟委員會于2016 年7 月13 日發(fā)布修訂法規(guī)（EU No.1143/2016）。在歐盟化妝品法規(guī)附錄Ⅵ（防曬劑列表） 中添加了納米級二氧化鈦，且規(guī)定其最大使用濃度為25%，并對其理化特性（如純度≥ 99%；金紅石型或不超過5% 銳鈦礦的金紅石型；中位粒徑≥ 30nm 等） 進行了限制。該項納米級二氧化鈦，不得用于可能吸入肺部的產(chǎn)品。

2.4 亞甲基雙- 苯并三唑基四甲基丁基酚（MBBT）

SCCS 于2015 年3 月25 日發(fā)表一項研究說明：對于符合一定規(guī)格的MBBT 納米顆粒，當以最高10% 的濃度用作防曬劑，以涂抹于皮膚的方式，施用于健康的、完整的皮膚以及受損的皮膚時，均不會對人體健康產(chǎn)生威脅。與另外三種防曬劑一樣，納米形式的MBBT 并不適用于可能通過吸入而增加肺部暴露量的使用形式。

根據(jù)SCCS 的觀點，同時考慮到科學技術(shù)的進步，歐盟委員會于2018 年6 月20 日發(fā)布法規(guī)修訂案（EUNo.885/2018），在《化妝品法規(guī)1223/2009》附錄Ⅵ中添加了納米級MBBT，并規(guī)定其最高使用濃度為10%，不得用于可能導致消費者發(fā)生肺部吸入風險的產(chǎn)品形式。

03安全研究相關(guān)技術(shù)手段

3.1 暴露風險

SCCS 認為，暴露風險的評估和潛在暴露途徑的確定是納米原料安全性評估的第一個關(guān)鍵決策點。這主要是因為通過機體暴露情況可以確定是否存在系統(tǒng)暴露風險。

值得注意的是，納米原料的應用形式、劑量和暴露場景都需要最大限度地模擬人體使用的真實情況。因為消費者在最終使用時，納米?？赡懿⒉煌谠趯嶒炇抑薪⒌募{米特征（例如穩(wěn)定的顆粒尺寸分布）。而對于給藥劑量，除了基于質(zhì)量的納米顆粒濃度外，還應根據(jù)顆粒數(shù)量、尺寸分布和表面積來計算濃度。以此來平衡暴露期間納米粒子因為聚集/ 降解/ 溶解所產(chǎn)生的影響。

納米原料對應的檢測方法也得較為成熟，需要有良好的準確度和重復性，檢測限也必須得足夠低，低至足以證明沒有潛在的暴露風險。而EM 方法正具備這種靈敏度，可直觀確認被吸收的納米粒是否以納米顆粒的形式存在于接收液或組織中。

3.2 危害識別與特征描述（劑量反應關(guān)系）

在毒理學評價中，納米粒的某些特性可能會因與周圍介質(zhì)的相互作用而發(fā)生變化。因此，需要重點考察測試時的納米粒是否與處方中的組成形式保持一致[30]。另外在應用劑量方面也需要特別注意，因為納米顆粒的濃度在測試過程中可能會由于沉降或與器皿間的黏附而降低。因此，確定納米粒在測試介質(zhì)中的穩(wěn)定性和均勻性是很重要的，以此確保在測試期間維持所施加的濃度/ 劑量。

對于體外遺傳毒性評估，應評估染色體損傷和基因突變程度。通常使用的細菌反向突變（Ames） 實驗并不認為適合用于納米粒的誘變性評估。由于細菌細胞壁的阻礙，細菌對納米粒的吸收非常有限甚至根本無法攝取[31]。因此納米粒子的內(nèi)化效應不太可能像在哺乳動物細胞中觀察到的那樣發(fā)生，因此該檢測方法的敏感性較差[32]。SCCS建議對納米粒進行以下體外遺傳毒性試驗：哺乳動物細胞染色體畸變/ 致裂性試驗（體外染色體畸變試驗或微核試驗）。微核試驗可以使用單核或細胞分裂阻斷方法進行。

04發(fā)展趨勢

由于歐盟禁止對化妝品成分/ 產(chǎn)品進行動物實驗，ICCR 對于新興納米原料的安全性評價變得更加困難，需要使用經(jīng)過驗證的替代方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物實驗。ICCR 明確規(guī)定，基于已知的納米材料安全評估信息來進行外推或類比，這種方法是不可取的。但是納米材料的總體風險特征是可以參考傳統(tǒng)材料的。這不光是非納米和納米形式之間，也可以是同一納米材料的不同納米形式之間進行毒性數(shù)據(jù)的推斷（橋接毒性方法）。例如短期毒性研究中類似的毒性特征、遺傳毒性或ADME 的研究結(jié)果。如果納米原料實際上與傳統(tǒng)材料存在較大出入，那么就有必要對納米原料的表征方法進行開發(fā)驗證，在最終制劑、局部和系統(tǒng)暴露期間進行毒理學評估。還需要開發(fā)并驗證能夠真實模擬體內(nèi)情況的體外模型，從而確定關(guān)鍵參數(shù)，完善預測機制，精準預判納米原料理化性質(zhì)、生物動力學行為以及毒理學結(jié)果。

而歐盟自身也積極推進符合“3R” 原則（減少、替代和優(yōu)化） 的替代方法的開發(fā)與驗證，《化妝品納米原料安全性評價指南》（SCCS/1611/19） 中，逐項討論了納米原料毒理學替代方法的建立與運用。例如，體外和離體模型、計算機建模和分類處理方法[33]、基于生理的藥代動力學（PBPK）[34] 或毒性動力學（PBTK） 建模方法[35]。但是目前大部分已通過證實的替代方法尚未通過用于納米原料的相關(guān)驗證，無法取代納米粒的標準化體內(nèi)毒理學評估方法[36]。因此這些新興方法的可行性還需要一定的案例研究來進行科學論證。

05結(jié)語

納米原料因其尺寸的特殊性，與傳統(tǒng)物料相比具有完全不同的理化特征、表面特性和生物學特征，因此有關(guān)納米原料的安全性一直是世界各國的重點關(guān)注對象。其中納米形式的TiO2 和ZnO 已經(jīng)作為最為常用的物理防曬劑在防曬產(chǎn)品中大量使用，這不禁引起了各機構(gòu)的擔憂。大量有關(guān)人體/ 動物的體內(nèi)外透皮研究表明，無論是在健康的皮膚中還是在受損的皮膚中，納米TiO2 或ZnO 都不會滲透到SC 以外的活性細胞中，更不可能進入全身血液循環(huán)。ICCR 與SCCS 也一致認為納米TiO2 是一種非敏化劑，對皮膚無刺激性，并得出結(jié)論：沒有證據(jù)表明皮膚接觸納米TiO2 后具有致癌性、致突變性或生殖毒性。因此歐盟委員會規(guī)定納米TiO2 和ZnO 在防曬產(chǎn)品中的最大使用濃度為25%。但是禁止以噴霧形式應用于化妝產(chǎn)品中，以防消費者因吸入納米顆粒而發(fā)生肺部暴露風險。

2021 年，我國《化妝品監(jiān)督管理條例》正式施行，在配套的《化妝品注冊備案資料管理規(guī)定》《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》中，首次提出了化妝品納米原料相關(guān)要求。與此同時，為了規(guī)范化妝品的安全評估工作，國家藥監(jiān)局又組織起草了《化妝品安全評估技術(shù)導則（2021 版）》[37]，其中詳細描述了化妝品原料的安全評估細則。雖然納米形式的原料并沒有提及，但是這對于將來納米原料的安全性評估也具有一定的奠基作用。

這些都意味著我國對于化妝品行業(yè)中納米原料的使用和管理將進一步規(guī)范[38]。這也對行業(yè)內(nèi)部的相關(guān)科研工作者提出新要求，需要對相關(guān)領(lǐng)域的國際審查動態(tài)和最新研究進展進行持續(xù)跟進，不斷健全和完善屬于中國自己的化妝品納米原料安全監(jiān)管體系。