余柯達(dá) 毛佳婷 包云 柴娟 高輝 師帥

第二性別比（secondary sex ratio，SSR）是出生時(shí)男嬰與女嬰數(shù)量的比值。在自然生育條件下出生嬰兒的SSR 為（106～110.2）∶100[1]，而通過輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）助孕出生嬰兒的SSR 顯著高于自然生育條件[2]。隨著社會(huì)的發(fā)展，通過ART 助孕出生的人口比例逐年增加，未來可能會(huì)對(duì)人口構(gòu)成產(chǎn)生不良影響。目前在ART 治療中不同發(fā)育階段的胚胎移植對(duì)SSR 的影響尚有爭(zhēng)議，多數(shù)研究結(jié)果表明囊胚與卵裂期胚胎移植后的SSR 無顯著差異性[3-7]，部分研究則表明囊胚移植后的SSR 顯著高于卵裂期胚胎[8-9]。丁錦麗等[10]通過Meta 分析發(fā)現(xiàn)，在新鮮周期中囊胚移植會(huì)使SSR 顯著升高，而對(duì)凍融周期未作探討。因此，有必要進(jìn)一步探究?jī)鋈谥芷谥胁煌l(fā)育階段胚胎移植對(duì)妊娠結(jié)局及SSR 的影響，從而為臨床實(shí)踐提供借鑒。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2019 年6 月至2021 年3 月在金華市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融胚胎移植的977 個(gè)周期。根據(jù)移植胚胎的發(fā)育階段分為第3 天卵裂期胚胎組（D3 組，699 個(gè)周期）和第5 天囊胚組（D5 組，278 個(gè)周期）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡＜40 歲；（2）接受體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的患者；（3）首次進(jìn)行胚胎移植的周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有習(xí)慣性流產(chǎn)史；（2）子宮因素不孕；（3）病例資料不全。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：IBR-2019066-R），所有患者均知情同意。

1.2 胚胎培養(yǎng) 根據(jù)患者情況采用對(duì)應(yīng)的促排卵方案，患者注射重組人絨毛膜促性腺激素（商品名：艾澤，德國(guó)默克雪蘭諾有限公司）34～36 h 后，在B 超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，行IVF/ICSI 授精，16～18 h 后觀察受精情況，雙原核為正常受精，D3 組于第3 天觀察胚胎卵裂情況，D5 組于第5 天觀察囊胚形成情況。卵裂期胚胎和囊胚的評(píng)價(jià)參考本院生殖醫(yī)學(xué)中心[11]和Gardner 等[12]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 玻璃化冷凍與復(fù)蘇 D3 組的可利用胚胎和D5 組的可利用囊胚均采用玻璃化冷凍試劑盒（日本加藤公司）進(jìn)行冷凍保存。將待冷凍的胚胎放入平衡液ES 中放置8～15 min，觀察到胚胎體積先收縮再恢復(fù)后，隨即將其轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液VS 中，在45～60 s 內(nèi)將胚胎加載至?；瘍龃婀埽ńK蘇云醫(yī)療器材有限公司）上，最后將其迅速投入液氮中。卵裂期胚胎和囊胚的復(fù)蘇均采用玻璃化解凍試劑盒（日本加藤公司）。將加載有胚胎的玻化凍存管迅速?gòu)囊旱D(zhuǎn)移至解凍液TS中放置1 min，然后將胚胎轉(zhuǎn)移至稀釋液DS 中放置3 min，再依次將其轉(zhuǎn)移至洗滌液WS1 和洗滌液WS2中各放置5 min，最后將復(fù)蘇后的胚胎放入胚胎移植液（瑞典Vitrolife 公司）中培養(yǎng)。

1.4 凍融胚胎移植 根據(jù)患者自身情況選擇內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。對(duì)排卵正常且內(nèi)膜生長(zhǎng)良好的患者一般采用自然周期，對(duì)于排卵異常、黃體功能不全或子宮內(nèi)膜薄的患者則采用人工周期?；颊哂趦?nèi)膜轉(zhuǎn)化后的第3 天移植卵裂期胚胎，第5 天移植囊胚?；颊咭浦?4 d 后測(cè)人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonad‐otrophin，hCG），hCG 陽性即生化妊娠，移植35 d 后進(jìn)行B 超檢查，可見孕囊的患者為臨床妊娠，分娩后電話隨訪母嬰情況。

1.5 觀察指標(biāo) 收集患者的一般信息和臨床結(jié)局資料，包括患者年齡、不孕年限、BMI、移植胚胎數(shù)、生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、總活產(chǎn)率（包括單胎活產(chǎn)率、雙胎活產(chǎn)率）、孕周、新生兒出生體重（包括單胎出生體重、雙胎出生體重）、早產(chǎn)率和SSR 等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。將臨床認(rèn)為與妊娠結(jié)局有關(guān)、單因素分析P＜0.15 的變量納入多因素logistic 回歸模型，篩選與凍融周期胚胎移植妊娠結(jié)局相關(guān)的獨(dú)立影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凍融周期卵裂期胚胎與囊胚移植的妊娠結(jié)局比較 D3 組和D5 組年齡、不孕年限、BMI、多胎妊娠率、異位妊娠率和流產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。D5 組移植胚胎數(shù)少于D3 組，而生化妊娠率、臨床妊娠率和胚胎種植率均高于D3 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 凍融周期卵裂期胚胎與囊胚移植的妊娠結(jié)局比較

2.2 凍融周期卵裂期胚胎與囊胚移植新生兒情況的比較 D3 組和D5 組孕周、雙胎活產(chǎn)率、出生體重、單胎出生體重、雙胎出生體重和早產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。D5 組總活產(chǎn)率、單胎活產(chǎn)率和SSR 均高于D3 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 凍融周期卵裂期胚胎與囊胚移植新生兒情況的比較

2.3 影響凍融周期胚胎移植妊娠結(jié)局的多因素logis‐tic 回歸分析 以妊娠結(jié)局為因變量（臨床妊娠、出生男嬰賦值=1，無臨床妊娠、出生女嬰賦值=0），將臨床認(rèn)為與妊娠結(jié)局有關(guān)、單因素分析P＜0.15 的因素作為自變量（年齡≤30 歲、BMI＜25kg/m2、卵裂期胚胎移植=0，年齡＞30 歲、BMI≥25 kg/m2、囊胚移植=1），進(jìn)行多因素logistic 回歸分析，逐步法排除無關(guān)項(xiàng)目。結(jié)果顯示，年齡＞30 歲、移植胚胎數(shù)和囊胚移植是凍融周期臨床妊娠的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05），囊胚移植是出生男嬰的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 影響凍融周期胚胎移植妊娠結(jié)局的多因素logistic 回歸分析

3 討論

SSR 是男女性別平衡的重要指標(biāo)，其受到多種因素的影響，SSR 的穩(wěn)定對(duì)于社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。在ART 過程中，早期胚胎暴露于體外環(huán)境會(huì)對(duì)SSR 產(chǎn)生一定的影響，目前比較明確的是授精方式[13-14]。此外雙親年齡、移植胚胎類型（新鮮胚胎/凍融胚胎）和移植胚胎發(fā)育階段（卵裂期/囊胚期）等也可能會(huì)影響SSR，但目前尚無明確定論[14]。胚胎序貫培養(yǎng)技術(shù)可以使早期胚胎順利發(fā)育至囊胚階段，在IVF/IC‐SI 治療中選擇囊胚移植，具有比卵裂期胚胎更高的胚胎種植率和臨床妊娠率[15]。目前囊胚移植已被國(guó)內(nèi)外各大生殖醫(yī)學(xué)中心廣泛應(yīng)用。由于不同發(fā)育階段的胚胎移植對(duì)SSR 的影響尚有爭(zhēng)議，因此本研究對(duì)凍融周期中不同發(fā)育階段的胚胎移植對(duì)妊娠結(jié)局及SSR 的影響進(jìn)行了探討。

本研究對(duì)凍融周期中的卵裂期胚胎與囊胚移植后的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，相比于D3 組，D5 組在移植胚胎數(shù)顯著減少的情況下，具有更高的生化妊娠率、胚胎種植率和臨床妊娠率，且總活產(chǎn)率和單胎活產(chǎn)率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Blake 等[15]的研究結(jié)果一致。本研究通過多因素logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡＞30 歲、移植胚胎數(shù)和囊胚移植是凍融周期臨床妊娠的獨(dú)立影響因素，進(jìn)行囊胚移植可以促進(jìn)臨床妊娠成功。在ART 治療中囊胚移植具有比卵裂期胚胎更優(yōu)的臨床結(jié)局的原因可能是，人類胚胎基因組的激活是在第3 天卵裂期胚胎之后，未被激活的胚胎會(huì)被淘汰，因此囊胚培養(yǎng)進(jìn)一步對(duì)胚胎進(jìn)行了自然篩選[16]，且囊胚移植更符合自然的生理狀況，胚胎-子宮內(nèi)膜發(fā)育具有更好的同步性[17]。

本研究探討了凍融周期中不同發(fā)育階段的胚胎移植對(duì)SSR 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D5 組SSR 高達(dá)146.75∶100，高于D3 組的101.12∶100，多因素logistic 回歸分析顯示，囊胚移植是凍融周期出生男嬰的獨(dú)立影響因素，與Li 等[3]和劉帥等[7]的研究結(jié)果不同，而與Chang等[18]和丁錦麗等[10]的Meta 分析結(jié)果一致。造成囊胚移植后的SSR 高于卵裂期胚胎的具體原因目前尚未明確。有研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的男性胚胎從桑椹胚發(fā)育到囊胚階段的葡萄糖代謝顯著高于女性胚胎[19]，表明男性胚胎比女性胚胎擁有更快的發(fā)育速度[9，20]，目前的囊胚評(píng)價(jià)方法導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)囊胚為男性胚胎的概率更大，而進(jìn)行囊胚移植的策略是選擇高質(zhì)量的囊胚，從而導(dǎo)致ART 周期的SSR 升高。

目前不孕不育患者進(jìn)行ART 治療時(shí)，臨床醫(yī)生往往會(huì)選擇給患者移植兩個(gè)胚胎，以確保獲得較高的臨床妊娠率，但也會(huì)導(dǎo)致患者多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)增加。多胎妊娠容易導(dǎo)致孕婦發(fā)生產(chǎn)前子癇、妊娠高血壓綜合征、妊娠期糖尿病、貧血和產(chǎn)后出血等嚴(yán)重并發(fā)癥[21-22]。本研究結(jié)果表明，本中心凍融周期中D3 組和D5 組的多胎妊娠率高達(dá)33.81%和35.09%。因此在維持較高臨床妊娠率的前提下，如何降低多胎妊娠率是本中心目前急需解決的問題。控制胚胎移植數(shù)是ART治療中降低多胎妊娠率最有效的手段，本中心D5 組的胚胎種植率高達(dá)47.65%，而D3 組的臨床妊娠率僅為49.93%，囊胚移植的胚胎種植率與卵裂期胚胎移植的臨床妊娠率相當(dāng)，因此本中心的移植策略可進(jìn)一步探討單囊胚移植的可行性，以減少多胎妊娠的發(fā)生。

綜上所述，凍融周期中行囊胚移植具有更高的胚胎種植率和臨床妊娠率，因此，建議將ART 周期中的早期胚胎培養(yǎng)至囊胚后再行移植或冷凍。目前國(guó)內(nèi)各省市對(duì)ART 治療進(jìn)入基本醫(yī)療保險(xiǎn)進(jìn)行了討論和試點(diǎn)，未來通過ART 出生的人口占比會(huì)越來越多，本研究結(jié)果表明凍融周期中囊胚移植會(huì)提高SSR，將來可能會(huì)對(duì)人口構(gòu)成產(chǎn)生影響。因此未來可進(jìn)一步對(duì)囊胚移植造成SSR 偏移的具體因素進(jìn)行詳細(xì)探討，并制定新的囊胚選擇和移植策略，以規(guī)避ART 治療中的SSR 偏移。