李琦,謝逸菲,張麗,呂揚(yáng),杜冠華

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.藥物晶型研究中心,晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

氘代藥物是指將原藥物分子結(jié)構(gòu)中特定位置的氫原子替換為氘原子的新興藥物,其克服了某些原藥物代謝不穩(wěn)定和毒性等問題。由于包含相同原子但不同穩(wěn)定同位素的化學(xué)反應(yīng)可以表現(xiàn)出不同的反應(yīng)速率,這一特征被稱為動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)(kinetic isotope effect,KIE)[1]。KIE使氘代藥物在不改變某些藥物原有活性的情況下改善原研藥物的藥動(dòng)學(xué)特征(pharmacokinetics,PK),以期改善藥物療效,延長半衰期,降低給藥頻率,減弱毒性,減少藥物-藥物相互作用[2]。

科學(xué)家們對(duì)氘代藥物的研究探索已有60多年歷史,直到2017年美國食品藥品管理局(FDA)才批準(zhǔn)世界第一個(gè)氘代藥物氘代丁苯那嗪(deutetrabenazine,DTBZ,商品名:安泰坦)上市,DTBZ最早由Auspex公司研發(fā),后來由TEVA公司接受,被FDA批準(zhǔn)用于治療亨廷頓舞蹈病[3-4]。丁苯那嗪是一種泡狀單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體-2抑制劑,通過抑制大腦突觸囊泡中儲(chǔ)存和釋放多巴胺發(fā)揮藥效,由于該藥半衰期短及不良反應(yīng),限制了其使用。丁苯那嗪氘代后的DTBZ能夠通過延長半衰期與峰值血漿濃度相關(guān)的不良反應(yīng)來降低藥物代謝并提高耐受性[3]。

長期以來,找到靈敏準(zhǔn)確的分析技術(shù)來檢測含有單一氘的化合物中氘含量是加速氘代藥物發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。通常情況下,區(qū)分同位素的檢測方法依賴于二者在原子質(zhì)量和核自旋上的不同,因此,氘代藥物的檢測分析通?；谫|(zhì)譜法(mass spectrometry,MS)和核磁共振法(nuclear magnetic resonance,NMR)原理來檢測同位素[5],核磁-質(zhì)譜聯(lián)用和液相-質(zhì)譜聯(lián)用是目前常規(guī)的檢測方法。目前用于氘代藥物分析的7種檢測技術(shù)見圖1,其中5種技術(shù)方法的原理、優(yōu)勢(shì)及不足見表1。

圖1 氘代藥物分析檢測方法

1 氘代藥物分析方法

已經(jīng)進(jìn)入臨床或上市的氘代藥物無論是在初期篩選氘代位點(diǎn)還是進(jìn)入臨床階段,MS和NMR都是目前最為常用的檢測方法。上述技術(shù)方法是目前氘代藥物結(jié)構(gòu)分析最普遍采用的技術(shù)手段,在此基礎(chǔ)上,研究人員還創(chuàng)新性地提出利用不同分子振動(dòng)頻率的光譜檢測方法,如IR和CARS,以及利用SXRD直接得到氘代藥物分子結(jié)構(gòu)。

1.1MS法 MS通過檢測離子質(zhì)荷比與相對(duì)強(qiáng)度關(guān)系對(duì)分析物進(jìn)行定性分析,同時(shí)利用離子強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。因此,通過氘代化合物的質(zhì)荷比差異能夠?qū)﹄幬镞M(jìn)行定性和定量分析。初步篩選氘代位點(diǎn)對(duì)藥理活性的影響與非氘代藥物相比是否發(fā)生變化,采用LC-MS方法時(shí)通常需要氘代與非氘代藥物兩種獨(dú)立的比較分析,而MS/MS方法不需要進(jìn)行獨(dú)立分析,可以作為氘代和非氘代類似物的快速篩選方法,RHYS等[9]采用MS/MS比值法比較在肝微粒體試驗(yàn)中同時(shí)混合的氘代和非氘代化合物之間的體外代謝穩(wěn)定性差異。氫同位素較MS與高分辨/高精度質(zhì)譜相結(jié)合的方法成功應(yīng)用于代謝-雄激素類固醇甲基烯酮代謝的研究,并已鑒定出40種代謝物[10]。

1.2NMR法 NMR法是利用原子核自旋時(shí)產(chǎn)生的磁矩來檢測分子結(jié)構(gòu),通常用于定性分析,很少用于定量分析。

阿伏苯宗的二酮和烯醇異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化會(huì)降低防曬霜的紫外線光穩(wěn)定性和光保護(hù)特性,利用固態(tài)NMR可以檢測氘代阿伏苯宗的二酮與烯醇轉(zhuǎn)化情況[11]?；凇昂舜殴舱裥盘?hào)強(qiáng)度(I)與激發(fā)核的數(shù)量(N)成正比”這一原理,NMR可用于定量檢測。采用定量核磁共振氫譜,加入內(nèi)標(biāo)物比對(duì),測定氘代碘甲烷中殘留的氫信號(hào),從而可以計(jì)算氘代率。定量核磁共振法的優(yōu)點(diǎn)是不需要自身對(duì)照品,且樣品前處理過程較簡便,因此將其應(yīng)用于氘代化合物的氘代率測定尤為合適[12]。

表1 不同氘代藥物檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)

1.3光譜檢測方法

1.3.1CARS CARS通過顯微鏡利用分子的固有振動(dòng)共振來驅(qū)動(dòng)光的非彈性散射,用含中子的較重同位素氘選擇性地取代氫,可誘導(dǎo)分子發(fā)生最小的結(jié)構(gòu)變化,這種方法可以被用作氘代藥物的定性或定量研究,目前該方法由于易受到光學(xué)參數(shù)干擾等原因并未在臨床上使用,但可為氘代藥物分析檢測技術(shù)發(fā)展提供思路。

使用氘代油酸來優(yōu)化設(shè)置一個(gè)內(nèi)部開發(fā)的多模態(tài)、多光子、激光掃描顯微鏡,精確識(shí)別在拉曼光譜的碳-氘相關(guān)的峰,通過數(shù)據(jù)分析程序?qū)⑵浞譃榛瘜W(xué)成分的敏感率和濃度,能夠在高光譜CARS圖像中識(shí)別特定氘代化學(xué)成分并定量空間分辨率[13]。BERGNER等[14]在雙通道微流控芯片中采用拉曼顯微光譜法和單波段CARS顯微鏡法,以對(duì)應(yīng)的非氘代(C-H)同位素為內(nèi)參物,研究具有脂肪族和芳香族C-D部分的藥物濃度依賴性。BOORMAN等[15]指出,拉曼散射系數(shù)和拉伸振動(dòng)的相干拉曼敏感性與氫同位素取代氘下的振動(dòng)頻率大致成比例,可為氘代化合物的定量分析提供思路。

1.3.2IR IR通過激發(fā)分子振動(dòng)獲得化合物的特征吸收光譜。由于分子振動(dòng)頻率取決于與激發(fā)態(tài)化學(xué)鍵中相關(guān)的原子質(zhì)量,因此C-H和C-D鍵中H與D原子之間的相對(duì)質(zhì)量差異使其吸收不同紅外波長輻射[16],因此可以區(qū)分氘與非氘鍵。筆者搜索近5年文獻(xiàn),并沒有發(fā)現(xiàn)利用IR對(duì)氘代藥物進(jìn)行檢測的研究,但HEINZE等[17]利用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflectance-fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)方法,在線測量水中氘濃度,可見利用IR對(duì)氘代藥物進(jìn)行檢測具有潛力。

1.4SXRD SXRD通常作為研究藥物分子晶型與共晶的檢測手段[18-19],目前較少見到有研究將其作為氘代藥物的檢測方法。

“小氫原子”理論模型認(rèn)為氫(氘)氣放電中產(chǎn)生了“小氫原子”,基態(tài)電子軌道半徑約為普通氫原子玻爾半徑的1/274,該小氫原子能級(jí)之間的躍遷能產(chǎn)生X射線新譜線[20]。LAALI等[21]合成一系列氘代姜黃素,利用核磁共振技術(shù)證實(shí)其酮-烯醛構(gòu)象類似于原類似物,在室溫下用二氯甲烷生長出適合單晶,采用SXRD法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步表征。

單晶X射線衍射法作為研究晶型藥物的主要檢測手段,已有研究提出“同位素多晶型”概念,其核心是通過同位素取代誘導(dǎo)獲得不同的晶體結(jié)構(gòu)[22]。FALK等[23]通過研究證明H-D交換可以避免模型化合物5-甲基-2-[(2-硝基苯基)氨基]-3-噻吩甲腈(5-methyl-2-[(2-nitrophenyl)amino]-3-thiophenecarbonitrile,ROY)伴隨多晶型生成,MA等[24]研究發(fā)現(xiàn)一種氘取代的鉑蛋白衍生物MBRI-001,作為微管蛋白聚合抑制劑,制備獲得晶型E(MBRI-001/H2O),利用粉末X射線衍射法(X-ray powder diffraction,PXRD)和SXRD表征并確定了晶型E結(jié)構(gòu),通過評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)其具有較好的物理穩(wěn)定性,適合規(guī)?；a(chǎn)。

2 氘代藥物及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)分析技術(shù)方法

2.1LC-MS聯(lián)用 MS是氘代藥物藥理活性以及進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段氘代藥物在人體內(nèi)代謝過程最為常用的檢測方法,通常與高效液相色譜等方法聯(lián)合使用。

沃替西汀(vortioxetine,商品名:Brintellix)是由日本武田制藥公司及丹麥靈北制藥有限公司共同研發(fā)的一種新型雙芳基硫烷基胺類多靶點(diǎn)抗抑郁藥物,2013年經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,其通過調(diào)節(jié)人體5-羥色胺受體并抑制5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮藥效。此外,沃替西汀還有效調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)活性[25-26]。氘代沃替西汀代號(hào)為JJH201501,由江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司研發(fā),是將沃替西汀中甲基氫替換成氘的新型藥物,目前已經(jīng)進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)階段,該藥化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2,氘代后的沃替西汀有效提升了藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性并可減緩代謝速度,從而達(dá)到增加藥效、減少藥物不良反應(yīng)的目的。

JH201501-01是氘代沃替西汀在體內(nèi)的主要代謝形式,結(jié)構(gòu)見圖2。I期臨床試驗(yàn)中,12例成年健康志愿者口服JJH201501片后,采用UPLC-MS/MS法對(duì)所采集的血樣進(jìn)行氘代藥物含量分析。方法學(xué)研究結(jié)果表明,該方法指標(biāo)均符合FDA提出的生物分析方法指南要求[27]。該分析方法目前已成功應(yīng)用于I期臨床試驗(yàn),可用于JJH201501及其主要代謝物JJH201501-01血漿濃度的臨床監(jiān)測。此外,應(yīng)用HPLC-MS/MS聯(lián)用建立大鼠血樣中氘代沃替西汀氫溴酸鹽(代號(hào):JJH201501)及其代謝物(代號(hào):JJH201501-01)的定量檢測方法,并可進(jìn)行重復(fù)給藥毒代動(dòng)力學(xué)研究[28]。

丁苯那嗪氘代后的DTBZ臨床試驗(yàn)主要采用LC-MS方法進(jìn)行評(píng)估分析[29]。SD-809-C-12試驗(yàn)[30]比較了單次口服劑量DTBZ和丁苯那嗪在禁食狀態(tài)下給藥后的作用效果。丁苯那嗪體內(nèi)活性代謝物為二氫四苯嗪(alpha-dihydrotetrabenazine,α-HTBZ)和二氫四苯嗪(beta-dihydrotetrabenazine,β-HTBZ),見圖3。采用LC-MS/MS分析法分別測定丁苯那嗪和DTBZ代謝物血漿濃度,評(píng)估DTBZ對(duì)活性代謝物PK特性、安全性和耐受性的影響。研究結(jié)果證實(shí),DTBZ活性代謝物在血液中的濃度增加了1倍,有效延長了代謝時(shí)間,并在原藥物劑量一半的給藥量下達(dá)到預(yù)期藥效[31]。

2.2MS-NMR法 MS-NMR法能夠準(zhǔn)確對(duì)氘代藥物及其代謝產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)及氘代位點(diǎn)進(jìn)行有效分析,因此較其他方法更適用于原研藥物PK研究。通常使用1HNMR、13CNMR和MS聯(lián)用表征藥物結(jié)構(gòu)。

奧西替尼(osimertinib,商品名:泰瑞莎,研發(fā)編號(hào):AZD9291)是由阿斯利康制藥有限公司研發(fā)的一種高效且有選擇性的第3代表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制劑,是目前晚期EGFR突變陽性非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療藥物[32]。AZD9291代謝物AZ5104具有毒性作用。研究發(fā)現(xiàn),將氘引入藥物分子中可以改變藥物的物理性質(zhì)和體內(nèi)代謝活性,因此蘇州澤璟生物制藥股份有限公司對(duì)AZD9291進(jìn)行氘代改造,篩選出氘代產(chǎn)物奧卡替尼,代號(hào)為氘代AZD9291。在篩選和合成氘代AZD9291過程中,每一步都通過1H和13C核磁共振譜和高分辨MS來確定合成產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)[33-34],最終合成氘代AZD9291的數(shù)據(jù)見表2。研究結(jié)果顯示,氘代AZD9291在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗腫瘤療效和良好的PK特性,且毒性明顯低于AZD9291,該藥目前已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)階段。

恩扎魯胺(enzalutamide,ENT,商品名:安可坦)是由安斯泰來制藥集團(tuán)研發(fā)的一種雄激素受體競爭性抑制劑,通過抑制核轉(zhuǎn)運(yùn)及其與DNA的結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡,該藥已于2012年被FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抗性前列腺癌的治療。但其存有潛在的癲癇發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)和劑量依賴性[35]?；衔镏蠧-H鍵的裂解是決定代謝速率的關(guān)鍵,氘在代謝過程中C-D鍵的裂解能夠阻礙藥物代謝速度并改變代謝途徑,同時(shí)有效增加藥物釋放并減少藥物毒性。ENT代謝譜顯示,ENT中N-去甲基苯甲酰胺(M2)的代謝是通過人類細(xì)胞色素P450同工酶CYP2C8和CYP3A4/5進(jìn)行。海創(chuàng)藥業(yè)股份有限公司研發(fā)了氘代恩扎魯胺,代號(hào)為HC-1119,當(dāng)N-甲基部分的氫原子被氘取代后,N-去甲基化途徑被減弱。研究表明,氘代恩扎魯胺在小鼠體內(nèi)顯示出更好的抗腫瘤活性,在體內(nèi)藥物釋放量升高[36],該藥目前已經(jīng)進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)研究。氘代恩扎魯胺最終通過MS和1H-NMR和13C-NMR來表征分子結(jié)構(gòu),數(shù)據(jù)見表2[37]。

圖2 氘代沃替西汀及其主要代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 DTBZ及其主要代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)

表2 氘代奧西替尼和氘代恩扎魯胺1H-NMR、13C-NMR、MS數(shù)據(jù)

3 總結(jié)與展望

當(dāng)前,氘代藥物定性檢測普遍采用NMR法,而在定量方面MS法應(yīng)用更為普遍。對(duì)于新型氘代藥物,篩選出具有活性氘代位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的藥物仍存在挑戰(zhàn)。目前,NMR法適用于氘代藥物前期分子結(jié)構(gòu)的初步篩查,LC-MS聯(lián)用法廣泛應(yīng)用于后期氘代藥物臨床藥理活性探究。單一分析方法并不普遍適用于大多數(shù)氘代藥物的定性或定量檢測,每種方法都因自身特點(diǎn)存在一定局限性,在IR法中,由于氘和氫的紅外吸收差異較小,更適合作為輔助檢測手段;SXRD需要得到適合進(jìn)行檢測的晶體,未來可以進(jìn)一步研究氘代藥物的晶型或共晶;CARS法對(duì)于氘的檢測信號(hào)強(qiáng)度低,容易受到光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)的影響,但是目前該技術(shù)有待進(jìn)一步深入應(yīng)用探究;MS法給出的碎片離子結(jié)構(gòu)信息具有一定局限性,可能會(huì)因?yàn)殡s質(zhì)干擾導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此需要對(duì)多種方法相結(jié)合的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析。LC-MS、NMR-MS法是目前最常用的聯(lián)合檢測方法。但任何新興藥物的發(fā)展都需要時(shí)間的積累,隨著科技的不斷進(jìn)步,氘代藥物檢測方法將越來越成熟,并將有助于推動(dòng)氘代藥物的發(fā)展。