李籽杉,杜澤飛,楊曉,丁豐,夏從龍,周萍,段寶忠

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院,大理 671000;2.云南省北花農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,云龍 672700)

金銀花為傳統(tǒng)中藥,來(lái)源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1],具清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功效,主要用于熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等[2-3]。以其作為原料生產(chǎn)的成藥有金銀花露、銀翹解毒片和雙黃連口服液等,素有“中藥青霉素”之稱[4]。金銀花含有酚酸類、黃酮類及萜類等多種成分[5-7],具有抗氧化、抗炎、抗菌及降血糖等藥理活性[8-10]。金銀花在我國(guó)種植廣泛,其中河南封丘、山東平邑和河北巨鹿為金銀花傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)[11]。近年來(lái)隨著市場(chǎng)需求不斷增大,金銀花栽培面積和種植地區(qū)日益擴(kuò)大,在云南、甘肅等地有大量引種栽培。研究表明,藥材質(zhì)量受氣候環(huán)境、海拔高度、采收期或種質(zhì)等的影響,不同產(chǎn)區(qū)金銀花樣品化學(xué)成分等存在差異[12-16]。由于不同產(chǎn)區(qū)金銀花加工后外形相似,僅憑肉眼難以區(qū)分,市場(chǎng)上以次充好、品種混淆等問(wèn)題普遍存在[17],影響了金銀花臨床應(yīng)用的有效性和安全性。因此,建立快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)地溯源方法,有助于實(shí)現(xiàn)金銀花樣品產(chǎn)地的快速識(shí)別,對(duì)保證金銀花臨床療效和維護(hù)市場(chǎng)健康發(fā)展具有重要意義。

藥用植物的產(chǎn)地溯源方法主要有紅外光譜、分子標(biāo)記以及穩(wěn)定同位素、礦物元素、色譜指紋圖譜等手段[18],其中紅外光譜具有操作簡(jiǎn)單、分析快速、樣品無(wú)耗損等特點(diǎn)[19],可間接反映樣品中化學(xué)組成信息,在臨床藥物篩選、糧食作物和中藥材的產(chǎn)地溯源以及質(zhì)量控制等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[20-22]。色譜指紋圖譜可從整體上表征復(fù)雜成分的特征性和相似性,已在蘆薈[23]、草果[24]、玉竹[25]等中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前,已有采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared,FTIR)對(duì)山東、河北、四川等產(chǎn)地,以及超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)指紋圖譜對(duì)山東和河南產(chǎn)地金銀花樣品質(zhì)量的評(píng)價(jià)研究[26-27],但筆者尚未見(jiàn)采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法探討金銀花產(chǎn)地溯源體系構(gòu)建的相關(guān)研究,尤其是道地產(chǎn)區(qū)山東與新產(chǎn)區(qū)云南的差異未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,筆者在本研究采用FTIR和UPLC指紋圖譜技術(shù),結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(hierachical cluster analysis,HCA)方法,對(duì)山東和云南產(chǎn)區(qū)金銀花樣品進(jìn)行研究,以期為建立金銀花樣品產(chǎn)地溯源和資源合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀(二元梯度泵、DAD檢測(cè)器)(美國(guó) Agilent 公司),Nexus FTIR儀(Thermo Nicolet 380),AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.1 mg],FY135型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),SB25-12D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),HW-3紅外烘干箱(天津市光學(xué)儀器廠),FW-4A型粉末壓片機(jī)(天津市拓普儀器有限公司),瑪瑙研缽。

1.2試藥 綠原酸(批號(hào):MUST-12031401)和木犀草苷(批號(hào):MUST-17121210)對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司,含量均≥98%。光譜級(jí)溴化鉀單晶粉末(天津天光光學(xué)儀器有限公司,批號(hào):170421),色譜級(jí)乙腈(Fisher Scientific,批號(hào):085884),磷酸溶液,甲醇,其他試劑均為分析純,水為超純水。

40批金銀花樣品(表1),采集于云南省和山東省,經(jīng)大理大學(xué)段寶忠教授鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾,憑證標(biāo)本保存于大理大學(xué)中藥標(biāo)本館。

2 UPLC指紋圖譜

2.1色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫程序:0～5 min,12%→15% A;5～10 min,15%→24%A;10～15 min,24%→33%A;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm;流速0.2 mL·min-1,進(jìn)樣量2 μL。在上述條件下,木犀草苷和綠原酸分離良好。

表1 金銀花樣品信息

2.2對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸與木犀草苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成綠原酸和木犀草苷濃度約為0.2 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 將不同品種金銀花樣品置于60 ℃干燥至恒重,粉碎過(guò)80目篩(篩孔內(nèi)徑0.178 mm),備用。分別取0.2 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶,加入50%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,室溫超聲40 min,超聲結(jié)束后加50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,上清液過(guò)孔徑0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 取同一金銀花供試品溶液(批號(hào):S1),按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,并對(duì)各共有峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行考察,計(jì)算得各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.62%,峰面積RSD為0.49%～1.61%,表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一金銀花樣品(批號(hào):S1)粉末0.2 g,精密稱定6份,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,并對(duì)各共有峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行考察,計(jì)算得到各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.04%～1.20%,峰面積RSD為0.50%～3.04%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一金銀花供試品溶液(批號(hào):S1),按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別在0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,各共有峰保留時(shí)間RSD為0.04%～1.58%,峰面積RSD為0.69%～2.98%,提示供試品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)綠原酸與木犀草苷混合對(duì)照品溶液,等比稀釋成一系列濃度混合對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積。以色譜峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣濃度(X,μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程分別為:綠原酸Y=1 176.9X-12.121(r=0.999 2),線性范圍為0.023 0～0.230 mg·mL-1;木犀草苷Y=4 676.1X+75.601(r=0.999 2),線性范圍為0.023 6～0.236 mg·mL-1。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量金銀花樣品(批號(hào):S1)粉末,平行6份,分別精密加入一定量混合對(duì)照品溶液,按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算得綠原酸、木犀草苷加樣回收率分別為99.60%,99.64%,RSD分別為0.71%,4.09%。

2.9樣品含量及指紋圖譜相似度分析 將40批金銀花樣品,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,進(jìn)樣記錄各樣品15 min色譜圖,采用指紋圖譜軟件處理,共獲得共有峰12個(gè),通過(guò)對(duì)照品保留時(shí)間確認(rèn)3號(hào)峰為綠原酸,8號(hào)峰為木犀草苷,色譜圖見(jiàn)圖1;各樣品中綠原酸、木犀草苷含量及樣品相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。含量分析顯示,在40批金銀花樣品中,有5批樣品(S18、S20、S21、S22、S29)綠原酸含量低于1.5%(表2),其中除S29以外,其余均為8月采收的“九豐一號(hào)”樣品。之前的研究顯示,“九豐一號(hào)”和“濟(jì)草堂一號(hào)”兩個(gè)金銀花花蕾中的綠原酸和木犀草苷含量從5月到9月逐漸減少[28]。從木犀草苷含量看,不同月份采收的金銀花樣品有一定差異,在40批樣品中,除S10和S22號(hào)樣品外,僅7月采收的九豐一號(hào)(S12～S16)樣品木犀草苷含量高于0.050%。綜合2種指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果,提示7月云南產(chǎn)區(qū)的“九豐一號(hào)”金銀花有效成分積累達(dá)到最高,可能由于7月是云南產(chǎn)區(qū)雨季,且溫度較高,此時(shí)具備金銀花植物生長(zhǎng)的最適氣候。此外,相似度計(jì)算結(jié)果顯示,40批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均>0.90,表明不同產(chǎn)地及不同品種金銀花樣品色譜峰總體穩(wěn)定。值得注意的是,雖然本研究提取方法與《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)相同,均為超聲提取,但本研究提取的溶劑為50%甲醇,相比《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)采用75%甲醇,本實(shí)驗(yàn)的提取方法具有更多色譜峰,提供了更多的變量信息以利于產(chǎn)地溯源。然而本研究結(jié)果也顯示,若按《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的限值規(guī)定,本研究中大部分樣品不符合要求,可能原因是提取溶劑影響了上述兩種成分的提取效率,導(dǎo)致兩種成分總量較低。在之前的研究中,李春燕等[29]發(fā)現(xiàn)在提取綠原酸時(shí),醇提優(yōu)于水提,可能原因是綠原酸含有羥基和鄰二酚基,極性與醇相對(duì)接近,一定程度上解釋了本研究的大部分樣品兩種成分的含量低于《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)規(guī)定限值的原因,這也是本研究的局限之一,有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.綠原酸;8.木犀草苷。

2.10系統(tǒng)聚類分析 將40批金銀花樣品共有峰相對(duì)于參比峰進(jìn)行峰面積量化,得到40 × 12階數(shù)據(jù)矩陣,采用SPSS 20.0版軟件作聚類分析,選用Ward's法和歐氏距離法進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。40批金銀花樣品可分為兩大類,來(lái)自山東的樣品S23～S30樣品單獨(dú)聚為一類;來(lái)自云南的樣品聚為一類,云南產(chǎn)區(qū)不同品種無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分;提示金銀花藥材質(zhì)量受產(chǎn)地影響較大,而受品種影響相對(duì)較小。

2.11主成分分析 將40批金銀花樣品進(jìn)行PCA分析,結(jié)果顯示前兩個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率>90.60%,PCA得分圖(圖3)顯示,40批樣品分成2類,來(lái)自山東的金銀花樣品S23～S30單獨(dú)聚為一類,產(chǎn)于云南的九豐一號(hào)S1～S22以及北花一號(hào)樣品S31～S40聚為一類,PCA結(jié)果與HCA結(jié)果基本一致,表明基于PCA方法可實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)金銀花樣品的識(shí)別,但無(wú)法區(qū)分同一產(chǎn)區(qū)的不同品種金銀花。

3 紅外光譜

3.1供試品的制備 取金銀花樣品粉末1.0 mg至瑪瑙研缽中,加入溴化鉀粉末200.0 mg作為分散劑,研磨均勻,取適量細(xì)粉平鋪于模具中,并以20 MPa壓強(qiáng)壓制1 min,取出,對(duì)光檢視,得到色澤均勻的透明錠片,備用。

3.2紅外光譜條件 光譜掃描范圍4000～400 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1,掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水(H2O)和二氧化碳(CO2)背景。

3.3數(shù)據(jù)分析 采用OMNIC 8.0版軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行坐標(biāo)歸一化、基線校正、平滑(點(diǎn)數(shù)15)處理。HCA分析使用SPSS 20.0版軟件,PCA分析使用SIMCA 13.0版軟件,二階導(dǎo)數(shù)采用Origin 8.5版軟件計(jì)算后繪制曲線。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)進(jìn)行相似度分析,參數(shù)設(shè)置為中位數(shù)法,時(shí)間窗寬度為0.1 min,自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜。

3.4精密度實(shí)驗(yàn) 以同一金銀花樣品(批號(hào):S1)為考察對(duì)象,按“3.2”項(xiàng)方法,連續(xù)重復(fù)掃描5次,所得紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.999 1～0.999 9,RSD為0.03%,表明精密度良好。

3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一金銀花供試品(批號(hào):S1)5份,按“3.1”項(xiàng)方法分別壓片,所得紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.998 8～0.999 6,RSD為0.06%,表明重復(fù)性良好。

3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一金銀花供試品(批號(hào):S1),分別在0,0.5,1,2,3,4,5 h,按“3.1”項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定,所得紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.980 8～0.998 6,RSD為0.7%,表明錠片在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7金銀花紅外光譜比較分析 不同產(chǎn)地金銀花平均紅外光譜見(jiàn)圖4,從圖中可見(jiàn),不同產(chǎn)地、不同品種及不同采收期金銀花樣品峰形、峰位基本一致,而強(qiáng)度有一定差異,表明所研究的金銀花樣品所含組分基本相同,積累量有一定差異。從樣品平均IR圖譜看,2800～3500 cm-1附近可能為烷基C-H對(duì)稱伸縮振動(dòng)和O-H伸縮振動(dòng)吸收峰[30];1800～1500 cm-1處可能為酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶的特征C=O伸縮振動(dòng),以及苯環(huán)的特征吸收[31];1200～1000 cm-1處為多糖、皂苷等物質(zhì)的混合振動(dòng)吸收區(qū)[32]。上述特征峰與金銀花樣品中黃酮類、酚酸類等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)吻合。

3.8紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)比較分析 為更好地顯示紅外光譜圖譜疊合蔽峰,本研究采用二階導(dǎo)數(shù)處理后對(duì)金銀花樣品間差異進(jìn)行了比較。在之前的研究中,鄒婧等[33]采用紅外光譜對(duì)金銀花樣品進(jìn)行溯源研究,發(fā)現(xiàn)來(lái)自5個(gè)產(chǎn)地的金銀花樣品可明顯區(qū)分,僅云南產(chǎn)地的樣品二階導(dǎo)數(shù)在3668 cm-1處有吸收峰,但該項(xiàng)研究用于建模的樣品數(shù)量?jī)H有1份,存在一定的局限性。本研究中,同一產(chǎn)地使用了多份樣本重復(fù),有效避免了由于偶然因素導(dǎo)致的誤差。從二階導(dǎo)數(shù)譜圖(圖5)可見(jiàn),九豐一號(hào)在3000～2750 cm-1波段范圍內(nèi),在2857和2921 cm-1處有吸收峰,而在北花一號(hào)樣品中,無(wú)類似的“鋸齒”吸收峰,據(jù)此可將兩個(gè)品種進(jìn)行區(qū)分。云南產(chǎn)九豐一號(hào)均在3250 cm-1附近有吸收峰,而山東產(chǎn)九豐一號(hào)中未發(fā)現(xiàn)3250 cm-1吸收峰,可將不同產(chǎn)區(qū)金銀花樣品區(qū)分。

表2 金銀花指標(biāo)成分含量測(cè)定及指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 金銀花樣品的UPLC聚類分析圖(n=40)

圖3 金銀花樣品UPLC主成分分析(n=40)

3.9層次聚類分析 將40批樣品原始譜圖進(jìn)行二階求導(dǎo)預(yù)處理,使用Ward's法和歐氏距離進(jìn)行HCA分析,結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可知,當(dāng)判別距離為20時(shí),樣本被分為兩類:第一類包括10批云南產(chǎn)北花一號(hào)(S31～S40);第二類包括30批九豐一號(hào)金銀花樣品,分別為8批山東產(chǎn)區(qū)(S23～S30)和22批云南產(chǎn)區(qū)(S1～S22);上述結(jié)果表明從IR二階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)來(lái)看,金銀花樣品品種對(duì)化學(xué)成分的影響大于產(chǎn)地。在判別條件距離為10時(shí),8批山東產(chǎn)九豐一號(hào)、22批云南產(chǎn)九豐一號(hào)和10批云南產(chǎn)北花一號(hào)各自聚為一支,可明顯區(qū)分,上述結(jié)果提示FTIR二階導(dǎo)數(shù)光譜可用于不同品種和不同產(chǎn)地的金銀花品種及產(chǎn)地溯源。

圖4 不同品種、產(chǎn)地、采收期金銀花紅外光譜圖

3.10主成分分析 PCA是一種無(wú)監(jiān)督多變量數(shù)據(jù)分析法,其在不損失主要信息的前提下實(shí)現(xiàn)降維,擴(kuò)大樣本之間的差異,可解決由于中藥成分復(fù)雜所致的譜帶重疊分析困難[34]。將40批金銀花樣品紅外光譜經(jīng)自動(dòng)基線校正+自動(dòng)平滑+縱坐標(biāo)歸一化+二階求導(dǎo)預(yù)處理后的數(shù)據(jù),進(jìn)行PCA分析,從PCA得分圖(圖7)可看出樣品被分為3類,與HCA結(jié)果一致。

4 討論

筆者在本研究中采用FTIR和UPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,對(duì)40批來(lái)自不同產(chǎn)地的金銀花藥材進(jìn)行研究。結(jié)果表明,基于UPLC色譜可實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)金銀花產(chǎn)地溯源,但無(wú)法識(shí)別同一產(chǎn)區(qū)不同品種的樣品,而FTIR光譜可實(shí)現(xiàn)金銀花品種和產(chǎn)地溯源。鑒于不同產(chǎn)區(qū)或不同品種金銀花在外形上的相似性,傳統(tǒng)性狀、顯微和理化鑒定方法存在一定局限性,金銀花樣品的混用對(duì)臨床用藥造成了一定的安全隱患。紅外光譜為多組分特征信息監(jiān)測(cè),對(duì)固態(tài)樣品僅需研磨等簡(jiǎn)單預(yù)處理,可實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)[35]。UPLC方法同時(shí)可實(shí)現(xiàn)有效成分含量的檢測(cè),結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法可對(duì)樣品的多元特征信息進(jìn)行提取和分析,易培訓(xùn)和推廣,為準(zhǔn)確判別金銀花的地理來(lái)源提供了一種新的客觀快速的方法,有望應(yīng)用于市場(chǎng)監(jiān)督領(lǐng)域,本研究為新方法的構(gòu)建提供了參考。

A.云南產(chǎn)九豐一號(hào)(5月);B.云南產(chǎn)九豐一號(hào)(6月);C.山東產(chǎn)九豐一號(hào)(5月);D.云南產(chǎn)九豐一號(hào)(7月);E.云南產(chǎn)北花一號(hào)(5月);F.云南產(chǎn)九豐一號(hào)(8月)。

圖6 不同品種和不同產(chǎn)地金銀花紅外光譜聚類分析圖(n=40)

圖7 不同品種和不同產(chǎn)地金銀花紅外光譜主成分分析圖(n=40)