宋丹妮,竇志英,范天慈,孫佳惠,張瑩,董妍玉,宋洪偉

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617;2.天津醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,天津 300222;3.江蘇省徐州市中醫(yī)院藥劑科,徐州 221000)

延胡索為罌粟科Papaveraceae紫堇屬CorydalisDC.植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖,其性溫,味辛、苦,歸心、肝、脾經(jīng),具有活血、散瘀、行氣、鎮(zhèn)痛功效。臨床常使用其醋制品,用于治療胸肋脘腹疼痛、胸痹心痛和跌打腫痛等[1]。

中藥材質(zhì)量除與產(chǎn)地、采收時(shí)間有關(guān)外,干燥是一個(gè)重要的影響因素[2]。前期研究發(fā)現(xiàn),煮制或蒸制后延胡索中淀粉粒糊化,質(zhì)地變硬角質(zhì)樣,因此有必要對(duì)延胡索干燥方法進(jìn)行研究,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。近年來(lái),傳統(tǒng)和現(xiàn)代干燥原理與技術(shù)的干燥方法逐漸應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地干燥加工,常用的中藥材現(xiàn)代干燥技術(shù)主要有熱風(fēng)干燥(烘干)、真空冷凍干燥、真空干燥等[3]。目前研究多針對(duì)不同干燥方法對(duì)成分含量的影響,對(duì)物性和成分溶出影響的報(bào)道筆者較少見(jiàn)到。硬度、折干率、復(fù)水率等因素是綜合反映藥材質(zhì)量的重要特征[4]。臨床上中藥煎煮多采用水提法,成分溶出與《中華人民共和國(guó)藥典》中濃氨-甲醇混合溶液提取有差異。因此,有必要對(duì)醋制延胡索干燥后物性參數(shù)和成分在水煎煮過(guò)程中的溶出規(guī)律進(jìn)行考察,尋找醋制延胡索適宜的干燥方式。

筆者在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定延胡索乙素、四氫非洲防己堿、去氫紫堇堿、四氫黃連堿、原阿片堿、非洲防己堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀等8種生物堿的溶出量,結(jié)合多個(gè)外觀特征指標(biāo),采用化學(xué)計(jì)量學(xué)綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量,探究曬干、烘干、真空干燥和真空冷凍干燥 4 種不同干燥方法對(duì)藥材物性和內(nèi)部成分溶出速度與程度的影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DHG-9245A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司),DZF-6020 型真空干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),LGJ-12 型真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司),GY-4型數(shù)顯式水果硬度儀(浙江托普儀器有限公司), 超高效液相色譜儀(UPLC)(Agilent 1290),ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司),KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),FA2004電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司,感量:0.000 1 g);DV215CD型電子天平(奧豪斯儀器有限公司,感量:0.000 01 g);離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司,型號(hào):DT5-2);FW100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 四氫非洲防己堿(批號(hào):W12N7Z24780,含量≥95%)、四氫黃連堿(批號(hào):R18A6F2,含量≥98%)、非洲防己堿(批號(hào):W30M7Z15501,含量≥98%)、鹽酸小檗堿(批號(hào):Y21A7S13543,含量≥98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限供公司;鹽酸巴馬汀(批號(hào):110732-201611,含量:86.8%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;延胡索乙素(批號(hào):W05-5-8,含量≥98.0%)、去氫紫堇堿(批號(hào):W14-2-4,含量≥98.0%)、原阿片堿(批號(hào):W14-2-6,含量≥98.0%)均購(gòu)自Zhongxin InnovaLaboratories;醋[食品級(jí),天津市天立獨(dú)流老醋股份有限公司,總酸含量≥3.50 g·(100 mL)-1,以乙酸計(jì)],乙腈(色譜純,默克股份兩合公司),甲醇(分析純,天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司),甲酸(Anaquachemicals supply),氨水(分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司),純化水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。延胡索購(gòu)于浙江省臺(tái)州市仙居縣朱溪鎮(zhèn),經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室馬琳教授鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖,樣品保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院炮制科研實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1醋延胡索樣品的制備 取鮮品延胡索,去除雜質(zhì),大小分檔,直徑>1 cm為大個(gè)延胡索,直徑<1 cm為小個(gè)延胡索。洗凈,切厚片,稍晾,加入適量醋,拌潤(rùn)待醋液被吸盡后,分別按以下方法進(jìn)行干燥加工處理。置電熱鼓風(fēng)機(jī)干燥(HAD);置日光下曬干(SD);置真空干燥箱內(nèi)干燥(VD);置于-20 ℃冰箱真空冷凍干燥 24 h。物料凍實(shí)后,快速將其平鋪于已預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)腔體內(nèi)的物料架上進(jìn)行真空冷凍干燥(FD)。見(jiàn)表1。

表1 醋制延胡索樣品與干燥方法

2.2復(fù)水率計(jì)算公式 RR=Mf/Mg,式中RR為復(fù)水率,Mf為干品復(fù)水瀝干后的質(zhì)量(g),Mg為復(fù)水前干品的質(zhì)量(g)。其中料水比為1：10,每種樣品重復(fù)4 次,取平均值[5]。

2.3折干率 折干率=(干燥后質(zhì)量/干燥前質(zhì)量)×100%[5]。

2.4硬度 GY-4型數(shù)顯式水果硬度儀測(cè)定樣品硬度,每種樣品重復(fù) 4 次,取平均值[6]。

2.5溶出量 取醋延胡索飲片,加水回流提取,分別于10,20,40,60,90和120 min取適量提取液,運(yùn)用UPLC色譜分析方法進(jìn)行延胡索乙素等藥效成分的檢測(cè),計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的溶出度。

2.5.1色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),乙腈(B)-0.2%甲酸(A)溶液,流速0.3 mL·min-1,柱溫55 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,進(jìn)樣量 1 μL;梯度洗脫 0～10 min,12%→14%B;10～14 min,14%→25%B;14～17 min,25%→40%B;17～20 min,40%→45%B;20～21 min,45%～12% B。見(jiàn)圖1。

1.四氫非洲防己堿;2.原阿片堿;3.四氫黃連堿;4.非洲防己堿;5.延胡索乙素;6.鹽酸小檗堿;7.鹽酸巴馬汀;8.去氫紫堇堿。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿,分別置10 mL量瓶,加甲醇溶解定容至刻度,得到濃度分別為 988,1002,990,988,1004,990,996和1000 μg·mL-1對(duì)照品溶液。量取上述四氫非洲防己堿對(duì)照品溶液 0.5 mL,原阿片堿對(duì)照品溶液 0.2 mL,四氫黃連堿對(duì)照品溶液1.5 mL,非洲防己堿對(duì)照品溶液0.1 mL,延胡索乙素對(duì)照品溶液0.5 mL,鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.1 mL,鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液0.2 mL,去氫紫堇堿對(duì)照品溶液0.5 mL,加甲醇定容至10 mL量瓶,配成上述對(duì)照品濃度分別為 49.4,20.0,148.5,9.9,50.2,9.9,19.9和50.0 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液。

2.5.3方法學(xué)考察 本課題組前期建立了檢測(cè)方法的方法學(xué)[7]。四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿8種生物堿的精密度RSD分別為1.00%,1.92%,0.73%,1.66%,0.95%,1.75%,1.05%和0.80%;穩(wěn)定性RSD分別為 1.85%,1.83%,1.86%,1.49%,1.60%,1.28%,1.38%和0.29%;重復(fù)性RSD 分別為1.52%,1.64%,1.05%,0.81%,1.66%,1.79%,1.94%和1.42%;加樣回收率 RSD分別為1.79%,1.83%,1.12%,1.94%,1.22%,1.93%,0.97%和1.22%。結(jié)果均符合含量測(cè)定要求,表明精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率良好。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1復(fù)水率 由表 2 可知,復(fù)水率范圍1.51～2.14 g·g-1,真空冷凍干燥>真空干燥>曬干>烘干。除曬干和真空干燥外,其余樣品兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且大小個(gè)規(guī)律一致,復(fù)水率一定程度上可以反映藥材的組織結(jié)構(gòu)特性,這是因?yàn)檎婵绽鋬龈稍锸菍⑽锪现械乃种苯佑杀顟B(tài)升華成氣體,保持了疏松多孔結(jié)構(gòu)[4],復(fù)水性較好,與其他3種干燥方法比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。烘干、真空干燥及曬干是由表及里的熱傳遞方式,烘干由于長(zhǎng)時(shí)間高溫,導(dǎo)致組織收縮及塌陷嚴(yán)重,物料形成相對(duì)致密的結(jié)構(gòu),復(fù)水率最低。真空干燥由于高真空度,限制了空隙的收縮,復(fù)水率次于真空冷凍干燥。

3.2折干率 由表2可知,折干率范圍在27.04%～34.30%,其中曬干>真空干燥>烘干>真空冷凍干燥。其中,烘干樣品和真空干燥樣品、大個(gè)曬干和真空干燥樣品差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余大個(gè)樣品和小個(gè)樣品兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。折干率是衡量藥材品質(zhì)和確定采收期的重要指標(biāo),受自身因素和外界環(huán)境因素影響[5]。真空冷凍干燥由于疏松多孔的結(jié)構(gòu),質(zhì)地較輕且含水量少,折干率顯著小于其他3種干燥方法。

表2 不同干燥方法對(duì)醋制延胡索飲片復(fù)水率、折干率、硬度的影響

3.3硬度 由表2可知,硬度范圍4.98～71.56N,烘干>曬干>真空干燥>真空冷凍干燥,4種干燥方法間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且大小個(gè)規(guī)律一致,烘干和曬干導(dǎo)致醋制延胡索表面結(jié)構(gòu)緊縮,硬度較大,真空干燥由于壓力差,使負(fù)壓狀態(tài)中的水沸點(diǎn)降低,物料易形成微孔結(jié)構(gòu)。真空冷凍干燥由于干燥后蓬松多孔結(jié)構(gòu)所以硬度最小。

3.4成分溶出量 結(jié)果見(jiàn)圖2。四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿在 0～20 min 真空冷凍干燥總?cè)艹隽亢腿艹鏊俾矢哂诤娓?、曬干及真空干燥。非洲防己堿、鹽酸小檗堿在 0～10 min真空冷凍干燥溶出速率高于其他干燥方式。真空冷凍干燥后,藥材疏松多孔,溶液易于浸潤(rùn),成分溶出快。真空冷凍干燥樣品中,藥效指標(biāo)性成分延胡索乙素在 10,20 min溶出量分別占總?cè)艹隽康?4%～57%,79%～81%;其他3種干燥方法分別占總?cè)艹隽康?24%～29%,51%～55%。烘干法和曬干法表面緊縮,質(zhì)地緊密,成分相對(duì)溶出慢。

8種成分總?cè)艹隽吭?0,60,90,120 min時(shí)大小順序均為烘干>真空干燥>曬干>真空冷凍干燥,且大小個(gè)趨勢(shì)一致。這可能是烘干法干燥速率快,對(duì)成分影響小,因此烘干樣品中成分總含量較高。以120 min最終溶出量為例,非洲防己堿和去氫紫堇堿為真空干燥樣品含量最高,但與烘干樣品差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四氫非洲防己堿、原阿片堿、鹽酸巴馬汀為曬干樣品中含量最高。其中,四氫非洲防己堿、鹽酸巴馬汀含量與烘干樣品中含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四氫黃連堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿為烘干樣品含量最高,且與其他樣品差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明烘干處理的醋延胡索飲片,適于提取其有效成分或有效部位,加水回流提取120 min獲得最大提取率。見(jiàn)圖3。

1.四氫非洲防己堿;2.原阿片堿;3.四氫黃連堿;4.非洲防己堿;5.延胡索乙素;6.鹽酸小檗堿;7.鹽酸巴馬汀;8.去氫紫堇堿。

考慮臨床中藥煎煮時(shí)間一般為 20～30 min,選取醋延胡索飲片,加水回流提取20 min時(shí)各成分溶出量和外觀特征指標(biāo)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià),深入挖掘信息。

圖3 不同干燥方法醋制延胡索樣品120 min各成分溶出折線圖

3.5聚類(lèi)分析 運(yùn)用SPSS 23.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。以8種成分含量、復(fù)水率、折干率、硬度為指標(biāo),采用組間連接法和歐氏距離對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同方法干燥的醋制延胡索樣品聚類(lèi)分析圖

本次分析可分為兩類(lèi):以真空冷凍干燥為一類(lèi),其余3種干燥方式為一類(lèi),大小個(gè)醋制延胡索規(guī)律一致,說(shuō)明真空冷凍干燥方法醋制延胡索樣品與其他3種干燥方式樣品有顯著差異。其余3種干燥方式能進(jìn)一步區(qū)分,提示3種不同干燥方式對(duì)醋延胡索質(zhì)量影響不同。通過(guò)測(cè)量外觀特征指標(biāo)和內(nèi)部多組分含量,結(jié)合聚類(lèi)分析,可以對(duì)醋延胡索質(zhì)量做出客觀評(píng)價(jià),具有良好的識(shí)別能力。

3.6主成分分析 在聚類(lèi)分析基礎(chǔ)上,以8種成分含量、復(fù)水率、折干率、硬度為分析變量,采用SPSS 23.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果表3、表4。

表3 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

表4 主成分分析載荷矩陣

如表3所示,第一主成分貢獻(xiàn)率53.18%,第二主成分貢獻(xiàn)率25.15%,前3個(gè)成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率93.51%,能反映大部分信息,預(yù)測(cè)結(jié)果合理。主成分分析載荷矩陣見(jiàn)表4,主成分1主要反映四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿、復(fù)水率等指標(biāo)信息,主成分2主要反映四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿信息。3個(gè)主成分均能反映延胡索乙素信息。利用SIMCA 14.0版軟件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督主成分,得到主成分得分圖,見(jiàn)圖5。主成分分析結(jié)果和聚類(lèi)分析結(jié)果一致,樣品被分為兩類(lèi):冷凍干燥為一類(lèi),其余為一類(lèi),大小個(gè)規(guī)律一致。說(shuō)明冷凍干燥效果與其他干燥明顯不同。冷凍干燥醋制延胡索硬度小,外觀特征良好,成分溶出快,便于臨床煎煮。以藥效指標(biāo)性成分延胡索乙素含量為主,綜合多組分含量和外觀特征指標(biāo),結(jié)合聚類(lèi)分析和主成分分析的評(píng)價(jià)方法可用于醋延胡索質(zhì)量控制。

圖5 主成分分析得分圖

4 討論

曬干法周期長(zhǎng),依賴(lài)自然條件,可控性差,外觀易改變,適合小批量藥材初干燥。烘干法以流動(dòng)熱風(fēng)加熱藥材并帶走水分,干燥設(shè)備成本低,效率高,溫度可控,適用于大多數(shù)中藥材的產(chǎn)地加工或干燥儲(chǔ)藏。真空冷凍干燥可以較好地保持原料色澤和成分,但需較高的能耗和設(shè)備投資,干燥時(shí)間較長(zhǎng),不適合大規(guī)模生產(chǎn)。真空干燥可以提高熱效率,適合熱敏性物質(zhì)的干燥加工,但存在運(yùn)行成本高、設(shè)備投入大的問(wèn)題,且干燥后中藥內(nèi)部結(jié)構(gòu)松泡,外部水分易再次進(jìn)入,不適合運(yùn)輸和長(zhǎng)期貯藏。在生產(chǎn)或研究中應(yīng)根據(jù)應(yīng)用目的和中藥特性選用合適的干燥方法[8-10]。

延胡索的主要有效成分為生物堿,其生物活性是多種組分共同作用的結(jié)果,因此單一延胡索乙素難以全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。但其他生物堿的藥理藥效研究較少,所占權(quán)重也尚不明確,所以多組分評(píng)價(jià)延胡索質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)需要進(jìn)一步研究完善[11]。

中藥溶出的速度與程度是中藥質(zhì)量及臨床中藥煎煮的重要影響因素,冷凍干燥醋延胡索飲片,在加水回流提取20 min 溶出速度和含量?jī)?yōu)于烘干、曬干以及真空干燥的醋延胡索飲片,制備飲片宜選用冷凍干燥。成藥生產(chǎn)或者研究過(guò)程中,需獲得成分最大含量,宜選用烘干樣品長(zhǎng)時(shí)間提取。筆者在實(shí)驗(yàn)中選用浙江產(chǎn)地延胡索,對(duì)不同干燥方式對(duì)醋制延胡索物性及溶出影響做了初步探究,干燥時(shí)間、溫度等干燥工藝對(duì)干燥效果和延胡索質(zhì)量的影響有待深入研究,為驗(yàn)證批次之間穩(wěn)定性以及產(chǎn)地之間的差異性還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考證。