張雷,張丹丹,尚會建,陳旭

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院,石家莊 050000)

根皮素(phloretin,PHL)是一種二氫查爾酮類天然產(chǎn)物,廣泛存在于蘋果、梨和其他多汁水果的果皮和果樹根皮中[1-2]。根皮素具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗腫瘤等生物和藥理活性[3-4],應(yīng)用于面膜、護(hù)膚膏霜、乳液和精華素等護(hù)膚品中[5-6]。由于水溶性差和生物利用度低,導(dǎo)致根皮素的應(yīng)用受到諸多限制。臨床上,因根皮素在水中溶解度僅0.02 mg·mL-1,導(dǎo)致其治療效果難以發(fā)揮[7-8]。目前,為提高根皮素溶解度以適應(yīng)臨床需求,需要研究新制劑來改良根皮素理化性質(zhì)[9-12],其中共晶因具有不破壞藥物活性成分以及更加穩(wěn)定的特性而受到關(guān)注[13]。

藥物共晶是指活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient,API)和共晶形成物(cocrystal former,CCF)之間通過氫鍵、鹵鍵等非共價鍵相互作用而堆積形成的超分子化合物[14-15]。空間堆積方式的改變導(dǎo)致藥物活性分子在形成共晶后的物理性質(zhì)發(fā)生部分變化,可改變藥物溶出[16]、溶解[17-19]、穩(wěn)定性[20-21]、生物利用度[22]、可壓縮性等重要參數(shù)。

目前已有文獻(xiàn)報道了幾種以根皮素為API的共晶,如根皮素-煙酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ晶型[23],根皮素-異煙酰胺[24],根皮素-甜菜堿[25]等共晶。研究表明,根皮素的某些共晶可在一定程度上增加根皮素平衡溶解度,并具有較好的溶解性能。筆者在本實驗對合成根皮素新共晶進(jìn)行研究,通過液體輔助研磨法、漿式結(jié)晶法及蒸發(fā)結(jié)晶法制備根皮素-4,4'-聯(lián)吡啶(4,4'-Bipyridine,BPY)共晶,以期增加根皮素溶解性能,提高根皮素生物利用度。

1 材料與方法

1.1儀器 粉末X-射線衍射儀(powder X-ray diffraction,PXRD):Rigaku D/max-2550,日本理學(xué)Rigaku公司。測試條件:電源設(shè)置40 kV、40 mA,Cu/Kα(λ=0.154 nm)射線源,掃描步長0.02 °,速度5 °·min-1,范圍5°～40°(2θ)[11]。熱重分析-差示掃描量熱儀(thermogravimetric analysis-differential scanning calorimetry,TG-DSC):STA 449 F5,德國NETZSCH公司。分析條件:氮氣流量50 mL·min-1,30～350 ℃下升溫10 ℃·min-1。傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR):Spectrum 400,美國PerkinElmer公司。元素分析(elemental analysis,EA):Vario EL Cube CHNS,德國Elemenlar公司。高效液相色譜(HPLC)儀:Agilent 1200,美國Agilent公司。檢測條件:Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm)。流動相:甲醇-0.4%磷酸鹽溶液(70：30)。溶出實驗儀:RC12AD配RZQ-12D取樣收集系統(tǒng),天大天發(fā)有限公司。藥品穩(wěn)定性實驗箱:DAA-1型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2試藥 根皮素(含量≥98.0%,批號:C14294776)、4,4'-聯(lián)吡啶(含量≥98.0%,批號:C13166696)由上海麥克林生化科技有限公司提供;丙酮(分析純,批號:20171125)由天津博迪化工股份有限公司提供;甲醇(色譜純,批號:20180808)、乙腈(色譜純,批號:20180208)、磷酸(分析純,批號:20170402)、無水乙醇(分析純,批號:20170918)由天津市大茂化學(xué)試劑廠提供;所有實驗用水均為超純水。

1.3實驗方法 準(zhǔn)確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯(lián)吡啶312 mg(物質(zhì)的量之比為1：1),置研缽中,緩慢加入無水乙醇0.25 mL,室溫(25 ℃)研磨30 min;或準(zhǔn)確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯(lián)吡啶312 mg(物質(zhì)的量之比為1：1),置潔凈錐形瓶,加適量無水乙醇于室溫(25 ℃)磁力攪拌12 h。過濾取濾餅,50 ℃條件下真空干燥24 h得白色粉末即為BPY共晶;或準(zhǔn)確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯(lián)吡啶312 mg(物質(zhì)的量之比為1：1),置干凈西林瓶,加無水乙醇4 mL和丙酮1 mL至溶質(zhì)全部溶解,封口膜封口,針扎3～5個小孔,置25 ℃潔凈環(huán)境中緩慢揮發(fā),48 h后長出針狀白色晶體,即為BPY共晶。

1.4分析方法 溶出性能評價:取PHL-BPY共晶、物理混合物和根皮素適量,經(jīng)孔徑150 μm(100目)藥篩篩分,取根皮素30 mg當(dāng)量3種物質(zhì),分別加入溶出介質(zhì)(水、pH值1.2鹽酸和pH值6.8磷酸鹽緩沖液)450 mL并置溶出實驗儀,設(shè)置溫度37 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速100 r·min-1,300 min內(nèi)間隔取樣用HPLC分析。以3000 min(50 h)的平衡濃度作為實驗的平衡溶解度。實驗結(jié)束后取各自殘留固體經(jīng)過濾、干燥并測定PXRD。

穩(wěn)定性評價方法:于培養(yǎng)皿中放置BPY共晶產(chǎn)物樣品100 mg,置(50±1) ℃下分別在0,10,30,60 d后取樣;高濕穩(wěn)定性實驗測試條件:置25 ℃下相對濕度(75±5)%恒濕密閉容器,分別在0,10,30,60 d后取樣。PXRD分析樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1PXRD分析結(jié)果 在PXRD譜圖中,新晶相形成會改變衍射峰形狀、強(qiáng)度及位置,因此可用于判斷共晶是否形成[26-27]。使用Origin軟件分析衍射圖,結(jié)果見圖1。

a:根皮素;b:4,4'-聯(lián)吡啶;c:液體輔助研磨結(jié)晶;d:漿式結(jié)晶;e:蒸發(fā)結(jié)晶。

圖1為制備的共晶產(chǎn)物與原料的PXRD譜圖對比。由圖1可知,研磨結(jié)晶、漿式結(jié)晶和蒸發(fā)結(jié)晶3種制備方法得到共晶產(chǎn)物的PXRD圖基本一致,可以認(rèn)為得到的為一種共晶,下文將3種制備方法得到的共晶統(tǒng)稱為共晶產(chǎn)物。共晶產(chǎn)物PXRD譜圖與根皮素、4,4'-聯(lián)吡啶的PXRD譜圖不同,原本歸屬于根皮素的6.93°,9.51°,16.52°,27.12°等位置特征峰,以及歸屬于4,4'-聯(lián)吡啶的10.16°,12.59°,17.80°,25.90°,27.98°等位置特征峰消失,而共晶產(chǎn)物在6.59°,11.82°,14.01°,19.26°,20.06°,23.90°等位置出現(xiàn)了不同于根皮素和4,4'-聯(lián)吡啶的新衍射峰。共晶產(chǎn)物PXRD譜圖中有新衍射峰出現(xiàn),證明有新晶相生成。且共晶產(chǎn)物中根皮素、4,4'-聯(lián)吡啶原料藥部分特征峰完全消失,說明共晶產(chǎn)物純度較高。

2.2TG-DSC分析結(jié)果 通過TG-DSC分析物質(zhì)熔點及熱失重過程。從DSC曲線可知原料藥及產(chǎn)物熔點變化[28-29],從TG曲線中可以看出原料藥及產(chǎn)物的熱分解過程[30],若有新的熔點出現(xiàn)以及不同的熱分解過程則可進(jìn)一步判斷是否形成共晶[31-32]。對DSC、TG數(shù)據(jù)結(jié)果分別分析。

本實驗所制備的共晶產(chǎn)物與原料的DSC譜圖見圖2,可知,根皮素在266.83 ℃處出現(xiàn)一個吸熱峰,與其熔點(267 ℃)一致。4,4'-聯(lián)吡啶在112.84 ℃處出現(xiàn)一個吸熱峰(195.30 ℃為4,4'-聯(lián)吡啶分解溫度),與其熔點(112.15 ℃)一致。共晶產(chǎn)物在222.36 ℃有一個吸熱峰,推測為其熔點。其中共晶產(chǎn)物的熔點與根皮素和4,4'-聯(lián)吡啶熔點均不相同。通常,共晶熔點介于API與CCF之間,產(chǎn)物符合這一特點,可作為判定新物相屬于共晶的一個佐證。

圖2 共晶產(chǎn)物與原料DSC譜圖

共晶產(chǎn)物與原料的TG譜圖見圖3。共晶產(chǎn)物的分解失重溫度(175 ℃)低于根皮素的分解失重溫度(257 ℃),高于4,4'-聯(lián)吡啶分解失重溫度(111 ℃)。并且在分解失重之前未見明顯失重,證明無結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑存在。失重溫度不同說明共晶產(chǎn)物與原料熱穩(wěn)定性不同,這與DSC分析結(jié)果一致。

2.3FT-IR結(jié)果 通過FT-IR可以判斷API與CCF之間是否形成新的非共價鍵[33-34]。對根皮素、4,4'-聯(lián)吡啶以及共晶產(chǎn)物進(jìn)行FT-IR分析,以檢測根皮素與4,4'-聯(lián)吡啶之間的相互作用以及晶體結(jié)構(gòu)的更多細(xì)節(jié)。

圖3 共晶產(chǎn)物與原料TG譜圖

結(jié)果見圖4,BPY共晶在3030,1620,1596,1534,802,730 cm-1產(chǎn)生紅外吸收峰,其中3030 cm-1為不飽和碳的νC-H吸收峰,1620 cm-1為根皮素中νC=O吸收峰,1596和1534 cm-1為νC=C和νC=N吸收峰,802和730 cm-1為芳香環(huán)吸收峰。由圖4可知,根皮素與4,4'-聯(lián)吡啶共同組成共晶。比較BPY共晶與根皮素、4,4'-聯(lián)吡啶FT-IR圖譜,在νO-H(2800～3600 cm-1)官能團(tuán)特征區(qū)處,共晶的FT-IR圖譜發(fā)生了變化,在形成共晶時不飽和碳的νC-H與根皮素中νO-H=3275 cm-1形成吸收峰共同紅移至3030 cm-1,推測為4,4'-聯(lián)吡啶中兩端的N原子與根皮素中的O-H形成的氫鍵,因此可以推斷根皮素與4,4'-聯(lián)吡啶形成共晶的方式為C=N…H-O的相互作用。這進(jìn)一步驗證了根皮素、4,4'-聯(lián)吡啶形成了BPY共晶。

圖4 共晶產(chǎn)物與原料FT-IR譜圖

2.4EA結(jié)果 通過EA可以測定產(chǎn)物中元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),從而確定共晶的化學(xué)計量比。通過使用元素分析儀將實驗樣品氧化燃燒,測定產(chǎn)生的3種氧化燃燒生成產(chǎn)物二氧化碳(CO2)、水(H2O)和氮氣(N2)的質(zhì)量,來確定碳(C)、氫(H)、氮(N)3種元素的含量,通過扣除確定的N、C、H元素可得O元素含量[35]。

結(jié)果見表1,BPY中各元素含量符合化學(xué)計量比根皮素：4,4'-聯(lián)吡啶為1：1的元素含量,所以BPY中根皮素與4,4'-聯(lián)吡啶化學(xué)計量比為1：1,即1 mol根皮素可與1 mol 4,4'-聯(lián)吡啶形成共晶。

表1 BPY共晶各元素含量

2.5HPLC分析 HPLC圖見圖5。根皮素保留時間為4.01 min,其雜峰對根皮素測定無干擾。

圖5 根皮素HPLC譜圖

2.6粉末溶出曲線與平衡溶解度 藥物在水性介質(zhì)中的溶解速度很大程度上決定了藥物生物利用度和功效。2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則中0931溶出度與釋放度測定法,實驗采用其中攪拌槳法進(jìn)行測定。

藥物的粉末溶出速率和平衡溶解度是影響其生物制藥性能的關(guān)鍵參數(shù)。對根皮素、物理混合物以及共晶產(chǎn)物在水、pH值1.2鹽酸、pH值6.8磷酸鹽緩沖溶液3種溶出介質(zhì)中的粉末溶出度和平衡溶解度進(jìn)行研究。根皮素、物理混合物以及共晶產(chǎn)物的粉末溶解曲線和平衡溶解度值分別見圖6-8。其中圖6為根皮素、物理混合物和共晶產(chǎn)物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中0～300 min內(nèi)溶出度曲線。共晶產(chǎn)物、物理混合物和根皮素在3種溶液中均可快速溶解。在pH值1.2和pH值6.8溶液中,共晶產(chǎn)物在初始快速釋放后可以保持穩(wěn)定。而在水中共晶產(chǎn)物在初期快速釋放后可以觀察到濃度快速上升和下降(“彈簧”效應(yīng)),可以歸因于相應(yīng)的根皮素形成了低溶性固體。

a:水;b:鹽酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)。

a:水;b:鹽酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)。

圖8 根皮素、物理混合物和共晶產(chǎn)物在水、鹽酸溶液(pH值=1.2)、磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)中的平衡溶解度

圖7為根皮素、物理混合物和共晶產(chǎn)物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中300～3000 min內(nèi)溶出度曲線。由圖可知,無論是根皮素、物理混合物還是共晶產(chǎn)物,其過飽和度即使在3000 min后仍能保持不變,這種過飽和根皮素的“懸停”現(xiàn)象可能與根皮素與4,4'-聯(lián)吡啶絡(luò)合有關(guān)。

由圖8可知,共晶體在水、pH值1.2和pH值6.8的3種溶液平衡溶解度分別為根皮素原料藥的1.20,1.60和1.12倍,分別為物理混合物的1.11,1.43和1.08倍,共晶產(chǎn)物平衡溶解度較根皮素原料藥、物理混合物均有相應(yīng)提高。

BPY共晶在不同溶劑中的溶出機(jī)制,可以通過溶出曲線及溶解后剩余固體PXRD圖譜(圖9)觀察。共晶產(chǎn)物在水溶液中的溶解原理,可以解釋為共晶在溶解過程中氫鍵會瞬間打開,導(dǎo)致共晶配體4,4'-聯(lián)吡啶溶解于水,這時難溶的根皮素會因為共晶結(jié)構(gòu)的突然坍塌而形成無定型態(tài),使根皮素溶解度產(chǎn)生一個峰值,即為“彈跳”現(xiàn)象,隨后根皮素又轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的低溶解性晶體,所以會導(dǎo)致根皮素的濃度下降,即“傘降”現(xiàn)象,因此BPY共晶在水溶液中的溶解機(jī)制與“彈跳-傘降”模型吻合。對于BPY共晶在pH值1.2的鹽酸溶液和pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液這兩種溶出介質(zhì)中,通過共晶溶解后殘留固體的PXRD圖譜以及溶出曲線可以猜想出共晶產(chǎn)物在整個溶解過程中一直以共晶形式存在,共晶中的氫鍵并沒有被打開,這與共晶產(chǎn)物在這兩種溶液中的溶出曲線并未出現(xiàn)“彈跳-傘降”現(xiàn)象一致。

a:根皮素;b:4,4'-聯(lián)吡啶;c:共晶產(chǎn)物;d:水溶解后;e:pH值1.2鹽酸溶解后;f:pH值6.8磷酸鹽緩沖溶液溶解后。

2.7穩(wěn)定性實驗結(jié)果 穩(wěn)定性研究表明,實驗得到的BPY共晶樣品不易降解,見圖10—11,BPY共晶在高溫[(60±1) ℃]和高濕[溫度25℃,相對濕度(75±5)%]條件下的PXRD圖譜均無顯著變化,表明上述樣品在高溫、高濕條件下均保持穩(wěn)定。產(chǎn)品適合工業(yè)化應(yīng)用、長期儲存及制備成口服固體制劑。

圖10 BPY共晶在高溫[(50±1)℃]條件下不同時間的PXRD圖譜

圖11 BPY共晶在高濕[溫度25 ℃、相對濕度(75±5)%]條件下不同時間的PXRD圖譜

3 討論

筆者在本實驗采用液體輔助研磨法、漿式結(jié)晶法以及蒸發(fā)結(jié)晶法制備新的BPY共晶,并采用PXRD、TG-DSC聯(lián)用、FT-IR、EA等方法進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)表征,確定了該產(chǎn)物為共晶產(chǎn)物。同時對共晶產(chǎn)物進(jìn)行了溶出速率、平衡溶解度以及穩(wěn)定性考察,實驗結(jié)果表明,與物理混合物和單獨根皮素原料相比,共晶可以提高根皮素的溶解性能,并且具有較好的溶解性能。穩(wěn)定性實驗表明,BPY共晶在高溫[(50±1) ℃]和高濕(溫度25 ℃,相對濕度75%)條件下分別具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。本研究為提高難溶性藥物溶出速率及溶解性提供了理論及技術(shù)支持,具有較好的應(yīng)用前景。