劉梅菊,謝逸菲,鄒瑤,喻紅梅,周健,龔寧波,呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.國(guó)家藥物篩選中心,北京 100050)

黃酮類化合物在自然界廣泛存在[1],根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可將其分為黃酮和黃酮醇、異黃酮、異黃烷酮、查耳酮、二氫查耳酮、黃烷和黃烷醇、黃烷二醇等十幾個(gè)類別[2],該類化合物具有抗氧化[3-4]、降糖[5-7]、抗腫瘤[8]、抗菌[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等多種生物活性,已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥保健行業(yè)研究熱點(diǎn)。異黃酮主要存在于豆科植物和中草藥中[11],主要的膳食異黃酮是染料木素和大豆異黃酮[12]。7-羥基異黃酮是大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物[13],分子式為C15H10O3,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。7-羥基異黃酮應(yīng)用十分廣泛,可作為重要的藥物中間體[14],用于合成治療骨質(zhì)疏松[15]、防止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散、治療冠心病等的多種相關(guān)藥物[16],近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其還具有光保護(hù)[17]、抗腫瘤[13]、抗病毒[18]等活性。

7-羥基異黃酮存在多晶型現(xiàn)象,本課題組前期研究獲得晶型7種[19],其中包括非溶劑晶型2種(晶1型和晶2型)和溶劑合物5種(二甲亞砜合物、N,N-二甲基甲酰胺合物、正丙醇合物、正丁醇合物和叔丁醇合物)。晶1型和5種溶劑合物均為亞穩(wěn)定晶型,在環(huán)境條件下會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型。在對(duì)7-羥基異黃酮進(jìn)行共晶研究、7-羥基異黃酮作為中間體或終端藥物生產(chǎn)的過(guò)程中,不可避免地會(huì)使用到各種溶劑,存在產(chǎn)生溶劑合物晶型雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,對(duì)7-羥基異黃酮溶劑合物的多晶型現(xiàn)象進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究,對(duì)于保證藥品安全性、有效性具有重要意義。

圖1 7-羥基異黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械化學(xué)法,制備獲得2種新的7-羥基異黃酮溶劑合物,分別為異戊醇合物和正辛醇合物,采用單晶X射線衍射分析(single crystal X-ray diffraction,SXRD)、粉末X射線衍射分析(powder X-ray diffraction,PXRD)、差示掃描量熱分析(differential scanning calorimeter,DSC)、熱重分析(thermo gravimetric analysis,TGA)和傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)等現(xiàn)代分析技術(shù)分別對(duì)2種新晶型進(jìn)行表征,并考察其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 7-羥基異黃酮(嘉興君康工貿(mào)有限公司,批號(hào):20070723,晶2型)、異戊醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào):20210801)、正辛醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào):20201211)。實(shí)驗(yàn)所用溶劑均為分析純。

1.1.2儀器 單晶X射線衍射儀:Rigaku MicroMax 002+單晶衍射儀,美國(guó)理學(xué)Rigaku公司;粉末X射線衍射儀:Rigaku D/max-2550粉末X射線衍射儀,日本理學(xué)Rigaku公司;差示掃描量熱儀:DSC1型,瑞士Mettler Toledo公司;熱重分析儀:TGA/DSC1型,瑞士Mettler Toledo公司;紅外光譜儀:Spectrum 400型,美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2方法

1.2.1溶劑合物的制備 7-羥基異黃酮-異戊醇:稱取7-羥基異黃酮60 mg,置瑪瑙研缽,加入異戊醇0.2 mL,研磨5 min,可得到異戊醇合物;7-羥基異黃酮-正辛醇:稱取7-羥基異黃酮60 mg,置瑪瑙研缽,加入正辛醇0.1 mL,研磨10 min,可得到正辛醇合物;晶體生長(zhǎng):分別取7-羥基異黃酮-異戊醇合物和7-羥基異黃酮-正辛醇合物粉末各20 mg,分別溶于適量異戊醇和正辛醇溶劑,濾過(guò),續(xù)濾液靜置,20～30 d獲得適用晶體。

1.2.2SXRD 采用單晶X射線衍射儀,CuKα輻射,共聚焦單色器,準(zhǔn)直光管直徑(ф)=0.30 mm,晶體CCD探測(cè)器距離d=45 mm,管壓45 kV,管流0.88 mA,ω與κ掃描方式。SHELXT(Sheldrick,2018)直接法解析晶體結(jié)構(gòu),最小二乘法進(jìn)行結(jié)構(gòu)參數(shù)校正,計(jì)算獲得溶劑合物的單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

1.2.3PXRD 采用粉末X射線衍射儀,CuKα輻射,石墨單色器,管壓40 kV,管流150 mA,2θ掃描范圍3～80°,掃描速度8°·min-1,步長(zhǎng)0.02°,發(fā)散狹縫DS=1°,接收狹縫RS=0.15 mm,散射狹縫SS=1°,數(shù)據(jù)使用MDI JADE軟件(Version 6.5)進(jìn)一步處理。使用Mercury軟件(Version 4.3.1,英國(guó)劍橋晶體數(shù)據(jù)庫(kù))計(jì)算獲得溶劑合物的理論P(yáng)XRD圖譜。

1.2.4DSC 采用差示掃描量熱儀,范圍30～250 ℃,升溫速率10 ℃·min-1,使用標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝,精密稱取樣品2～4 mg,檢測(cè)。使用STAR軟件包對(duì)譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.5TG 采用熱重分析儀,將樣品約8 mg置于氧化鋁坩堝,溫度30～500 ℃,升溫速率5 ℃·min-1,以氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣,氣體流速50 mL·min-1。使用STAR軟件包對(duì)譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.6FT-IR 采用傅里葉變換紅外光譜儀,衰減全反射法,光譜掃描范圍4000～450 cm-1,儀器分辨率4.0 cm-1。使用SPECTRUM軟件包對(duì)譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.7穩(wěn)定性考察方法 將樣品置于常溫[(20±2)℃]、高溫[(60±2)℃]2種實(shí)驗(yàn)條件下,于第0,5,10天分別取樣通過(guò)PXRD評(píng)估樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1SXRD 通過(guò)分析前期獲得的7種晶型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn),5種溶劑合物都結(jié)晶于單斜晶系,P21/c或P21/n空間群,溶劑分子均參與到分子的結(jié)構(gòu)組成,其中醇性溶劑作為重要的紐帶,穩(wěn)定分子的穩(wěn)定排列,由此推導(dǎo)其他類型的醇性溶劑也可以參與到7-羥基異黃酮的多晶型分子結(jié)構(gòu)中。

進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),7-羥基異黃酮-異戊醇合物屬于單斜晶系,P21/c空間群,不對(duì)稱單元中包含1個(gè)7-羥基異黃酮分子和1個(gè)異戊醇分子,與已報(bào)道的5種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu)相似,但晶胞參數(shù)存在顯著差異。7-羥基異黃酮-正辛醇合物屬于單斜晶系,P21空間群,不對(duì)稱單元中包含4個(gè)7-羥基異黃酮分子和4個(gè)溶劑分子,與其他6種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu)差異較大。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1,構(gòu)象疊合圖見(jiàn)圖2(黃色:異戊醇合物;紅色:正辛醇合物),2種溶劑合物主體分子的構(gòu)象基本一致。

表1 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

圖2 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的構(gòu)象疊合圖

2種溶劑合物中都含有兩類O-H…O氫鍵,一類為7-羥基異黃酮分子中的-OH(氫鍵供體)和溶劑分子中-OH的O原子(氫鍵受體)存在的氫鍵聯(lián)系(O3-H3…O4),另一類為7-羥基異黃酮分子中羰基的O原子(氫鍵受體)和溶劑分子中的-OH(氫鍵供體)存在的氫鍵聯(lián)系(O4-H4…O2)。氫鍵是連接7-羥基異黃酮分子和溶劑分子的關(guān)鍵因素,7-羥基異黃酮分子中的羥基和羰基基團(tuán)為分子間氫鍵的形成提供了可能,由此可進(jìn)一步探索更多7-羥基異黃酮的新晶型和共晶物。2種7-羥基異黃酮溶劑合物中的氫鍵參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 2種7-羥基異黃酮溶劑合物中的氫鍵參數(shù)

2種7-羥基異黃酮溶劑合物的分子堆積圖見(jiàn)圖3。在異戊醇合物中,異戊醇同時(shí)作為氫鍵供體和受體將7-羥基異黃酮分子和溶劑分子連接起來(lái),形成一條沿著c軸的Z型鏈狀結(jié)構(gòu),與已報(bào)道的正丙醇合物和正丁醇合物結(jié)構(gòu)類似。在正辛醇合物中,正辛醇也同時(shí)作為氫鍵供體和受體將7-羥基異黃酮分子和溶劑分子連接起來(lái),以4分子的7-羥基異黃酮和溶劑為結(jié)構(gòu)基元,沿著a軸方向形成帶狀結(jié)構(gòu)。

圖3 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的分子堆積圖

2.2PXRD 根據(jù)SXRD數(shù)據(jù),使用Mercury軟件計(jì)算獲得2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論P(yáng)XRD圖譜,2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論與實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜見(jiàn)圖4。2種晶型衍射峰的數(shù)量、位置、強(qiáng)度和峰形幾何拓?fù)渚休^明顯差異,其PXRD圖譜具有指紋性,可實(shí)現(xiàn)2種晶型物質(zhì)的有效鑒別。異戊醇合物的指紋性表現(xiàn)為其較強(qiáng)的特征衍射峰(以2θ表示),分別為4.62°,14.44°,15.16°,17.08°,18.88°,21.96°,22.38°,23.40°,25.04°,25.48°,25.90°,28.92°。正辛醇合物的指紋性表現(xiàn)為其較強(qiáng)的特征衍射峰(以2θ表示),分別為3.74°,14.30°,16.70°,22.72°,23.94°,26.42°。其理論P(yáng)XRD圖譜還可作為晶型識(shí)別與質(zhì)量控制的對(duì)照?qǐng)D譜使用,為7-羥基異黃酮藥物中多晶型“雜質(zhì)成分”的質(zhì)量控制提供了標(biāo)準(zhǔn)與科學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜中衍射峰的數(shù)量、位置和強(qiáng)度與理論P(yáng)XRD圖譜均一致,足以證明采用機(jī)械化學(xué)法成功制備得到了7-羥基異黃酮-異戊醇合物和7-羥基異黃酮-正辛醇合物,且該樣品可用于2種新晶型的進(jìn)一步表征研究。

圖4 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論及實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜

2.3DSC 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜見(jiàn)圖5,DSC吸熱峰數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。異戊醇合物和正辛醇合物的DSC曲線與已報(bào)道的正丙醇合物、正丁醇合物以及叔丁醇合物相似,均在7-羥基異黃酮熔融吸熱峰前出現(xiàn)失去溶劑的吸熱峰,但該吸熱峰的數(shù)量、位置不盡相同,這不僅與溶劑本身沸點(diǎn)有關(guān),也反映溶劑與7-羥基異黃酮之間相互作用力的大小[20]。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜各不相同,表明DSC技術(shù)可實(shí)現(xiàn)2種晶型物質(zhì)有效鑒別[21]。

2.4TG TG法是在程序控溫的條件下,測(cè)定物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度變化的一種分析技術(shù)[22],可用來(lái)測(cè)定溶劑合物中所含溶劑的化學(xué)計(jì)量數(shù)[23]。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的TG圖譜見(jiàn)圖6。異戊醇合物和正辛醇合物的TG圖譜都有2個(gè)失重臺(tái)階,第1個(gè)失重臺(tái)階由溶劑損失導(dǎo)致,失重百分比分別為26.0%,39.3%,以此計(jì)算出7-羥基異黃酮與異戊醇和正辛醇的化學(xué)計(jì)量比分別為1：0.95,1：1.18,與通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到的1：1化學(xué)計(jì)量比大致吻合;第2個(gè)失重臺(tái)階由7-羥基異黃酮熔融分解導(dǎo)致。

2.5FT-IR 7-羥基異黃酮原料及2種溶劑合物的IR圖譜見(jiàn)圖7。由于溶劑的介入,分子間作用力發(fā)生改變,導(dǎo)致IR圖譜出現(xiàn)峰形、峰位、峰強(qiáng)的差異[24]。相較于7-羥基異黃酮原料,在異戊醇合物和正辛醇合物的IR圖譜中,由于分子間氫鍵的形成,1621 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)峰吸收強(qiáng)度稍有增強(qiáng);3248 cm-1處的O-H伸縮振動(dòng)峰吸收強(qiáng)度稍有減弱,異戊醇合物在此處的峰分裂成2個(gè)峰。

2.6穩(wěn)定性研究 異戊醇合物和正辛醇合物均為亞穩(wěn)定晶型,在常溫條件[(20±2) ℃]和高溫條件[(60±2) ℃]下會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型,與已報(bào)道的5種溶劑合物結(jié)果相同。

3 討論

筆者在本研究采用機(jī)械化學(xué)法,成功獲得2種7-羥基異黃酮新晶型,分別為7-羥基異黃酮-異戊醇合物(1：1)和7-羥基異黃酮-正辛醇合物(1：1)。采用SXRD、PXRD、DSC、TG、FT-IR等不同分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了表征研究,報(bào)道了2種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu),其PXRD圖譜具有指紋性,DSC圖譜有明顯差異,可實(shí)現(xiàn)2種晶型物質(zhì)的有效鑒別。對(duì)2種溶劑合物進(jìn)行了穩(wěn)定性研究,發(fā)現(xiàn)其均為亞穩(wěn)定晶型,可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型。

圖5 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜

表3 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC吸熱峰數(shù)據(jù)

圖6 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的TG曲線

圖7 7-羥基異黃酮原料及其溶劑合物的IR圖譜

本研究結(jié)果提示,7-羥基異黃酮易于形成溶劑合物,除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的7種溶劑合物外,在使用其他醇類有機(jī)溶劑時(shí),還存在形成其他亞穩(wěn)態(tài)7-羥基異黃酮溶劑合物的可能,在制備和生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)注意避免7-羥基異黃酮溶劑合物雜質(zhì)的產(chǎn)生,并應(yīng)對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的晶型質(zhì)量控制,以保證藥品的安全性和有效性[20,25]。