譚順梓,向珺昱,夏玉樺,尤程程,黃利鳴,黃益玲

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實驗室,宜昌 443002;2.三峽大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系,宜昌 443002;3.湖北省恩施市中心醫(yī)院婦科,恩施 445000)

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤,發(fā)病率及病死率均居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位[1-2]。以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療 (concurrent chemoradiotherapy,CCRT)是目前治療晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)方法,但相關(guān)臨床研究顯示,30%～40%患者達(dá)不到預(yù)期效果[3],化學(xué)治療(化療)藥物對非癌細(xì)胞的不良副作用和耐藥的產(chǎn)生成為常規(guī)化療的主要阻礙[4]。為解決這一問題,目前相對較新且有效的治療方法是聯(lián)合化療。植物提取物因?qū)C(jī)體正常細(xì)胞毒性低、副作用小等優(yōu)勢,成為研究聯(lián)合用藥化療增敏劑的主要對象[5]。在順鉑增敏的聯(lián)合用藥研究中,SAHIN等[6]發(fā)現(xiàn),從豆科植物提取的植物蛋白金雀異黃素可通過抑制核因子κB(NF-κB)和Akt/mTOR信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)順鉑對宮頸癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng);WANG等[7]發(fā)現(xiàn),木犀草素(一種類黃酮類物質(zhì))能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞遷移增敏順鉑治療卵巢癌作用。天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)從栝蔞(葫蘆科植物)的塊根中提取而來,屬于Ⅰ型單鏈核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),TCS對宮頸癌、淋巴瘤、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞生長具有抑制作用[9-11]。TCS與順鉑聯(lián)合用藥的研究報道筆者較少見到,本研究觀察TCS對順鉑治療宮頸癌HeLa細(xì)胞的增敏作用,并初步探討其機(jī)制,以期為臨床聯(lián)合用藥治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗儀器 細(xì)胞孵育箱(美國Thermo Fisher有限公司,型號:Heracell VIOS 160i);全波長酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技有限責(zé)任公司(中國),型號:Powerpac200型];光學(xué)顯微鏡(日本尼康株式會社,型號:T-DH);全自動倒置熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司,型號:IRX60);高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特股份有限公司,型號:Microfuge 20R);流式細(xì)胞儀(常州必達(dá)科生物科技有限公司,型號:EFXLOW-206);轉(zhuǎn)膜儀(北京剴元信瑞儀器有限公司,型號:MP-8005);顯影儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司,型號:ChemiScope mini);pH計(上海精密儀器儀表公司,型號:PHS-3C)。

1.2細(xì)胞與試劑 宮頸癌HeLa細(xì)胞株(原始細(xì)胞購于武漢大學(xué)典藏中心,由湖北省腫瘤微環(huán)境與免疫治療重點(diǎn)實驗室保存與培養(yǎng),批號:GDC0009),TCS(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院,自行提取),順鉑(美國Sigma公司,批號:PHR1624),改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基干粉(美國Gibco公司,批號:812451),1640液體培養(yǎng)基(美國Gibco公司,批號:8121314),胰蛋白酶(美國Gibco公司,批號:BL512A),胎牛血清[FBS,武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司,批號:164210];細(xì)胞計數(shù)檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK8,日本同仁生物科技公司,批號:CK04);Cocktail蛋白酶抑制劑(購自美國Sigma公司,批號:B14001),二甲亞砜(DMSO,美國Sigma公司,批號:D2650),凋亡試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號:KGA105),BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司,批號:2019120306),蛋白Mark(美國Thermo Fisher公司,批號:26616)),Trizol裂解液(美國Invitrogen公司,批號:15596026),羊抗鼠、羊抗兔二抗(武漢科瑞科技業(yè)有限公司,批號分別為GB23204、GB23301),增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液(北京普利萊基因生物技術(shù)有限公司,批號:GB23204、GB23301),細(xì)胞裂解液(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,批號:C1053-100);一抗:β-actin(美國Cell Signaling Technology公司,批號:4970),促凋亡蛋白(Bax,美國Proteintech公司,批號:02701),抗凋亡蛋白(Bcl-2)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[the poly(adp-ribose)polymerases,PARP](成都正能生物技術(shù)有限公司,批號分別為381702,381835)。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)及實驗分組 將含HeLa細(xì)胞的懸液用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)均勻培養(yǎng)于無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)皿置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng),3～5 h內(nèi)不動,待細(xì)胞貼壁。將對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞分為4組:對照組不做處理;TCS組加入0.7 μg·mL-1TCS,順鉑組加入2 μg·mL-1順鉑,TCS+順鉑組加入0.7 μg·mL-1TCS及2 μg·mL-1順鉑,誘導(dǎo)48 h后用于后續(xù)實驗。

1.3.2CCK-8法檢測細(xì)胞活力 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至2.5萬個·mL-1,96孔板每孔加入細(xì)胞懸液200 μL,置細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。第2天按“1.3.1”項分組,換液加藥處理,TCS組與順鉑組均設(shè)濃度梯度7個,TCS組:TCS 0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 μg·mL-1,順鉑組:順鉑 0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0 μg·mL-1,TCS+順鉑組TCS+順鉑(0.1+0.5)、(0.2+1.0)、(0.4+2.0)、(0.8+4.0)、(1.6+8.0)、(3.2+16.0) μg·mL-1。每個濃度設(shè)復(fù)孔5個,重復(fù)實驗3次,檢測時間均為48 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到48 h,吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基將CCK8原液稀釋成10%CCK8工作液。每孔加入CCK8工作液100 mL,再置細(xì)胞培養(yǎng)箱避光。孵育30 min,取出96孔板,全波長酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長460 nm處各孔吸光度(A)值。藥物對細(xì)胞生長抑制率計算公式:藥物對細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3.3人工劃痕實驗 收集對數(shù)生長期狀態(tài)良好細(xì)胞,計數(shù),按每孔20萬個細(xì)胞接種于6孔板,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。倒置顯微鏡觀察,細(xì)胞生長融合度達(dá)70%時劃痕。200 μL槍頭順直尺垂直劃線,PBS輕輕吹洗細(xì)胞2次,去除劃下細(xì)胞,按照實驗分組加入提前準(zhǔn)備好的含藥低濃度培養(yǎng)基6 mL(含2%FBS培養(yǎng)基),并設(shè)對照組(貼壁細(xì)胞與2%FBS低濃度培養(yǎng)基)。立即在光學(xué)顯微鏡下攝影留存,再置細(xì)胞培養(yǎng)箱培育,分別于培育24,48 h后立即采集攝影。

1.3.4Transwell遷移實驗 按實驗分組處理細(xì)胞48 h,分組收集活細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至20萬個·mL-1。分別取細(xì)胞懸液200 μL,置Transwell上室(室內(nèi)無基質(zhì)膠),24孔板內(nèi)擇4孔作為下室,各加入含20%FBS的培養(yǎng)基800 μL,將上室與下室重合后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出24孔板內(nèi)上室,棉簽輕輕將上室濾膜上層細(xì)胞抹去,甲醇固定30 min。固定后的上室以PBS輕輕清洗3次,再置于0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色30 min。光學(xué)顯微鏡下放大200倍,觀察記錄已穿過的細(xì)胞數(shù)量,取圖保存。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔2×105個接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后,分組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基至6 mL,48 h后冷PBS洗滌,分組收集細(xì)胞沉淀。將收集的細(xì)胞按照凋亡試劑盒說明書染色處理,3個加藥組EP管內(nèi)加入Binding buffer工作液懸浮細(xì)胞300 μL,空白對照組加入Binding buffer工作液懸浮細(xì)胞1.2 mL,均勻分成4份,分裝入4個新EP管,分別行不加任何染料、FITC-Annexin V單染、PI單染、FITC-Annexin V+PI雙染處理,作為4個對照組。加藥組細(xì)胞懸液避光加入Annexin V-FITC染色液5 μL,輕輕混勻后避光孵育5 min。隨后每管樣品避光加PI染色液2 μL,輕輕混勻,繼續(xù)避光孵育。30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測凋亡指標(biāo),分析圖像。

1.3.6Western blotting實驗 按實驗分組收集已用藥物處理48 h的細(xì)胞,在冰上用蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞30 min,4 ℃高速離心,取上清液,收集蛋白樣品。按BCA試劑盒說明書配比蛋白樣品,置酶標(biāo)儀,在波長562 nm處測定蛋白樣A值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=937.7X-20.855)計算蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量和所測得的蛋白濃度計算所需蛋白上樣體積。將蛋白樣與上樣緩沖液按體積比4：1加入上樣緩沖液,沸水浴煮沸10 min后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉(sodium dodeoyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濃縮膠電壓60 V,分離膠電壓80 V。濕轉(zhuǎn)蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。TBST配制8%脫脂牛奶,膜封閉1 h,換用一抗,將膜置4 ℃冰箱搖床孵育過夜(不超過16 h)。第2天常溫下用TBST洗滌膜3次,每次10 min。二抗室溫?fù)u床孵育1 h,再次洗膜3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯色,X膠片曝光、顯影、定影,以β-Actin為內(nèi)參。Image J圖像分析軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值,行統(tǒng)計學(xué)分析對比。

2 結(jié)果

2.1TCS與順鉑對HeLa細(xì)胞增殖的抑制效果 實驗結(jié)果顯示,不同濃度TCS、順鉑,以及兩藥聯(lián)合對HeLa細(xì)胞增殖均有抑制作用,且具有濃度依賴性。與同濃度順鉑組比較,TCS+順鉑組HeLa細(xì)胞抑制率顯著更高(P<0.05),見表1。提示TCS對順鉑有很好化療增敏作用。

2.2CI曲線 根據(jù)CCK-8實驗計算TCS組、順鉑組及TCS+順鉑組細(xì)胞增殖抑制率,利用CompuSyn軟件計算CI值,繪制CI值曲線(圖1)。根據(jù)藥物聯(lián)用選擇原則(CI>1拮抗,CI=1疊加,0.6

2.3劃痕實驗與Transwell實驗結(jié)果

2.3.1劃痕實驗結(jié)果 見圖2。對照組細(xì)胞劃痕48 h后基本愈合;與對照組比較,TCS組、順鉑組與TCS+順鉑組愈合速度減慢;與順鉑組比較,TCS+順鉑組遷移能力明顯停滯,幾乎無遷移能力。

2.3.2Transwell實驗結(jié)果 結(jié)果見圖3。光學(xué)顯微鏡下可見,穿過Transwell小室的HeLa細(xì)胞數(shù),對照組>順鉑組>TCS組>TCS+順鉑組,提示TCS+順鉑組對HeLa細(xì)胞遷移的抑制能力較其他3組強(qiáng)。

2.4HeLa細(xì)胞凋亡情況 見圖4。與TCS組及順鉑組比較,TCS+順鉑組HeLa細(xì)胞凋亡比例明顯更高。

2.5Western blotting結(jié)果 結(jié)果見圖5。與對照組比較,其他3組凋亡底物蛋白PARP被降解產(chǎn)物c-PARP水平明顯上調(diào),促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降。可見,TCS+順鉑較順鉑促HeLa細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng)。

表1 4組HeLa細(xì)胞生長抑制率測定結(jié)果

圖1 劑量效應(yīng)曲線(A)與CI曲線圖(B)

3 討論

筆者在本實驗觀察TCS聯(lián)合順鉑抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡等的協(xié)同作用,結(jié)果顯示,TCS與順鉑均對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖具有抑制作用,兩藥聯(lián)合對HeLa細(xì)胞抑制作用更明顯,且具有劑量依賴性。順鉑對HeLa細(xì)胞IC50為(3.90±0.82)μg·mL-1,與TCS聯(lián)合用藥后,IC50降至(1.28±0.36)μg·mL-1,提示TCS聯(lián)合順鉑抗癌有協(xié)同效應(yīng),可降低順鉑劑量,減少不良反應(yīng),這對于臨床用藥有指導(dǎo)意義。腫瘤遷移是影響患者預(yù)后的重要因素,本研究中,筆者通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),順鉑抵抗腫瘤細(xì)胞作用較弱,但與TCS聯(lián)用后能顯著降低HeLa細(xì)胞遷移能力。這可能是TCS蛋白對宮頸癌HeLa細(xì)胞順鉑化療增敏的關(guān)鍵機(jī)制之一[12-15]。

①與對照組比較,t=-1 004.47～-345.01,P<0.01;②與TCS+順鉑組比較,t=-85.82～-5.43,P<0.05。

①與對照組比較,t=-18.61,P<0.01;②與TCS+順鉑組比較,t=-6.56,P<0.05;③與對照組比較,t=-4.77,P<0.05;④與TCS+順鉑組比較,t=-31.08,P<0.01。

①與TCS+順鉑組比較,t=-2.12,P<0.05;②與TCS+順鉑組比較,t=-12.77,P<0.01。

順鉑是宮頸癌一線化療藥物,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤重要機(jī)制之一[16-17]。本研究從細(xì)胞凋亡角度探討TCS化療增敏作用的可能機(jī)制,發(fā)現(xiàn)TCS與順鉑聯(lián)用可增加HeLa細(xì)胞凋亡比例。Bcl-2蛋白家族是內(nèi)源性凋亡途徑關(guān)鍵蛋白,對于線粒體中細(xì)胞色素C的釋放,并激活下游Caspase蛋白凋亡級聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要[18]。Bcl-2家族包含3個功能和結(jié)構(gòu)不同的亞家族:抗凋亡蛋白,包括Bcl-2,Bcl-xL,Mcl-1,Bcl-w,Bag-1和A1;促凋亡效應(yīng)蛋白Bax和Bak;促凋亡蛋白BH3[19]。筆者在本實驗發(fā)現(xiàn),TCS對順鉑化療增敏的作用機(jī)制與增加凋亡底物蛋白PARP的切割活化、升高促凋亡蛋白Bax表達(dá)、降低凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)有關(guān)。筆者后續(xù)還將從細(xì)胞遷移信號通路及動物實驗等角度進(jìn)一步探索TCS對順鉑化療增敏的作用機(jī)制,以期為臨床提高宮頸癌治療效果提供實驗依據(jù)。

①與對照組比較,t=-21.72～44.24,P<0.05;②與對照組比較,t=-1 559.8～-4.68,P<0.01;③與順鉑組比較,t=-801.6,P<0.05;④與順鉑組比較,t=-53.34,P<0.01。