◎ 孫晶瑋，鐘松清

（深圳三方圓檢測監(jiān)管服務(wù)有限公司，廣東 深圳 518000）

水質(zhì)重金屬污染是危害較大的水污染問題之一。鎘是一種常見的重金屬，有劇毒。人們長期飲用含鎘殘留的水，會對人體腎臟、肝臟和生殖系統(tǒng)造成不可逆的損傷。目前，檢測重金屬鎘的方法有石墨爐原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[1-3]等，這些方法具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，但需要昂貴的大型儀器設(shè)備、專門的實驗室和專業(yè)的操作技術(shù)人員，不適用于大宗樣品的快速篩查。因此，急需建立一種高效、便捷、低成本的重金屬鎘檢測方法，實現(xiàn)水中重金屬鎘的現(xiàn)場快速篩查。

納米材料的研究已成為當今國際上的前沿研究課題，熒光微球作為熒光探針標記生物大分子，在分析領(lǐng)域已有重要的應(yīng)用[4-5]。時間分辨熒光微球是基于鑭系元素發(fā)光的新型標記材料，其特點是通過延遲讀取發(fā)射光時間以區(qū)分特異性熒光信號和基質(zhì)背景熒光信號，提高檢測靈敏度高[6]。

本研究采用了熒光微球標記抗體，建立重金屬鎘的新型、快速、實用、靈敏的納米熒光免疫層析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鉛、汞、鎘、鉻、銅和鐵標準品（1 000 mg·L-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；鎘抗體、鎘抗原（純度95.0%，深圳市三方圓生物科技股份有限公司）；熒光微球，南京微測生物科技有限公司；玻璃纖維墊、硝酸纖維素（NC膜），Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

劃膜儀、數(shù)控斬切機，上海金標生物科技有限公司；分析天平，美國Sartorius公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標記抗體

吸取5 μL熒光微球于2 mL離心管中，加入40 μL 0.05 mol·L-1MES緩 沖 溶 液（pH 4.7），混 勻， 13 500 r·min-1離心20 min，去掉上清，加入40 μL上述緩沖液溶解沉淀，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移入另一2 mL離心管中，超聲30秒；分別加入4 μL N-羥基琥珀酰亞胺溶液 （10 mg·mL-1）和2 μL碳二亞胺溶液（5 mg·mL-1），室溫靜置活化反應(yīng)30 min，13 500 r·min-1離心20 min， 去掉上清，加入40 μL MES緩沖溶液（pH 4.7）溶解沉淀，超聲處理1 min，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中；加入適量待標記抗體，避光，室溫搖床振蕩 1 h；再加入5 μL 10%BSA，封閉1 h，13 500 r·min-1離心15 min，去掉上清，加入50 μL復(fù)溶液超聲復(fù)溶沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備熒光檢測卡

檢測卡由PVC底板、樣品墊、耦聯(lián)物墊、NC纖維素膜和吸水墊組成。通過實驗條件的優(yōu)化，確定最佳抗原包被量、熒光抗體使用量及羊抗鼠二抗工作濃度。使用滑膜儀將抗原稀釋液和羊抗鼠二抗稀釋液分別包被在NC膜上，形成檢測線T和質(zhì)控線C，將制備好的NC反應(yīng)膜置于50 ℃烘箱中干燥1h；將適宜濃度的熒光微球標記的抗體均勻噴涂在耦聯(lián)物墊上，于室溫干燥，備用；裁剪玻璃纖維膜，磷酸緩沖液（1% BSA，0.5%吐溫）浸泡30 min，室溫干燥，備用；將上述樣品墊、耦聯(lián)物墊、NC反應(yīng)膜和吸水墊依次粘貼在PVC底板上，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 熒光檢測卡裝置解析示意圖

將組裝好的檢測卡大板切成5 mm寬的檢測條，裝入檢測卡殼中，組裝后的檢測卡放入帶有干燥劑的鋁箔袋中，封口，室溫保存。

1.3.3 熒光檢測卡的判讀

本文采用競爭的方法研制檢測重金屬鎘的免疫熒光檢測卡。檢測樣本中的待測目標物在流動過程中先與熒光微球標記的特異性單克隆抗體相結(jié)合，再帶著標記抗體繼續(xù)層析，未結(jié)合的標記抗體與NC膜檢測線（T）上包被抗原結(jié)合。如果樣本液中含有目標物，檢測線（T）顯色較淺或不顯色，結(jié)果為陽性；反之，檢測線（T）顯色與質(zhì)控線（C線）相同或略深，結(jié)果為陰性；若質(zhì)控帶無顯色，表明實驗無效。

1.3.4 標準曲線繪制

將1 000 mg·L-1的 鎘 標 準 品 溶 液 與1 mol·L-1的EDTA溶液混合，靜置反應(yīng)15 min，用0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液將上述標準品溶液稀釋為1 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1和40 μg·L-1的標準品工作溶液。分別取80 μL加至檢測卡的樣品孔中，室溫下反應(yīng)8～10 min。以T/C比值為縱坐標，標準品濃度的lg值為橫坐標，繪制標準曲線圖。

1.3.5 熒光檢測卡穩(wěn)定性實驗

制備3批熒光檢測卡，在室溫保存12個月，測試的時間為第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天以及第360天，檢測其敏感性變化。

1.3.6 熒光檢測卡特異性實驗

選取與目標待測物性質(zhì)相同的同系物進行檢測，根據(jù)交叉反應(yīng)，檢測所建立的熒光檢測卡的特異性。

1.3.7 重金屬檢測樣本處理方法

如果水較混濁需要過濾，則取1 mL待測水樣，加入一滴含絡(luò)合劑的0.02 mol·L-1PBS緩沖液（pH 7.4），混勻，沸水浴5 min，待恢復(fù)室溫后用一次性滴管取2～3滴（或用移液槍取80 μL）進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標記抗體量的確定

確定鎘抗體與1 mg熒光微球的最佳偶聯(lián)量，分別檢測對應(yīng)的標準品，用免疫熒光層析檢測儀記錄檢測卡的T/C比值。

如圖2所示，隨著抗體標記量增加，T/C比值逐漸增大，鎘抗體量達到200 μg·mg-1時T/C比值最大，超過該值后，T/C比值逐漸降低，表明抗體加入量不是越多越好，分析可能是由于結(jié)合到熒光微球表面的抗體達到飽和，出現(xiàn)了空間位阻，導(dǎo)致標記抗體與抗原結(jié)合量降低，從而使檢測信號降低。因此確定熒光標記抗體量為200 μg·mg-1。

圖2 抗體標記量的確定圖

2.2 標準曲線的建立

根據(jù)T/C比值與標準品濃度的lg值繪制標準曲線圖，如圖3所示，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.995，線性范圍在1～40 μg·L-1，半抑制率為8.7 μg·L-1，最低檢測限為1.5 μg·L-1。

圖3 重金屬鎘的標準曲線圖

2.3 檢測卡的性能

通過分析比較重金屬鎘與鉻、鉛、汞、銅和鐵檢測結(jié)果的顯色情況，分析評估鎘熒光檢測卡的特異性。檢測結(jié)果如表1所示，重金屬鎘熒光檢測卡與其余金屬離子的交叉反應(yīng)率較低，表明本試劑盒的特異性較好。

表1 重金屬鎘特異性表

按照1.3.5實驗方法，將3批次檢測卡在室溫下保存，測試的時間為第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天和第360天，考察其檢測敏感性變化。實驗結(jié)果顯示，檢測卡在外觀、敏感性上無顯著差異，說明所制備的檢測卡穩(wěn)定性較好。

按照1.3.7樣本處理方法，檢測自來水、純凈水、河水等樣本，分別添加不同濃度水平的重金屬鎘離子，每個添加樣品測試5次，并計算加標回收率。由表2可知，回收率在85.7%～105.1%，準確度較好；變異系數(shù)在5.4%～10.8%，平均變異系數(shù)低于15%。

表2 重金屬鎘的添加回收率表

2.4 與儀器分析法的對比

目前我國檢測生活飲用水中重金屬的標準為《生活飲用水標準檢驗方法金屬指標》（GB 5750.6—2006）[7]，石墨爐原子吸收光譜法的最低檢測限為0.5 μg·L-1。 為對比兩種檢測方法，選擇陰性樣品和添加量為20 μg·L-1的陽性樣本進行檢測，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，兩種方法的檢測結(jié)果較為一致，表明本熒光檢測卡可以用于檢測水中鎘的快速篩選。

3 結(jié)論

本研究在重金屬鎘單克隆抗體的制備基礎(chǔ)上，開發(fā)了鎘的納米熒光免疫層析檢測卡，經(jīng)過一系列優(yōu)化，確定本方法的線性范圍為1～40 μg·L-1，靈敏度為 8.7 μg·L-1，最低檢測限為1.5 μg·L-1。該方法前處理簡單方便，與傳統(tǒng)的儀器分析法結(jié)果符合性較高，適用于基層現(xiàn)場快速檢測。