顏羽昕, 高曉陽, 張春艷, 金 蓉, 袁宏偉, 馬月宏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 呼和浩特 010000

肝纖維化是慢性肝損傷進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段,主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM)合成和降解失調(diào),內(nèi)皮間隙的ECM從正常的低密度基底膜樣基質(zhì)向含有纖維形成膠原的間質(zhì)型基質(zhì)轉(zhuǎn)變,使ECM異常沉積,膠原成分大量增加,最終影響肝臟正常的功能[1-2]。其中,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[3],HSC向成肌纖維細(xì)胞過渡的過程中,會受到肝細(xì)胞及其他細(xì)胞的相互影響,并參與傷口愈合反應(yīng)范圍內(nèi)的細(xì)胞通路激活的調(diào)節(jié),其激活后產(chǎn)生大量ECM,這是導(dǎo)致肝纖維化形成的主要原因[4]。在激活狀態(tài)下,HSC失去儲備維生素A脂滴的能力,表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和ECM成分[5-6]。不過,肝纖維化是可逆的,特別是在早期纖維化階段,及時(shí)阻斷發(fā)病原因或增加ECM降解可以使纖維化緩解或消退[7]。藍(lán)盆花為常用蒙藥,又名蒙古山蘿卜花,具有澀、鈍、燥、膩、熏、涼等特性,清熱平“希拉”之功效[8-9],此外它在蒙醫(yī)中可單用,主要用于發(fā)熱、黃疸、肝熱癥、肝中毒等治療[10],但其對肝纖維化的作用機(jī)制尚不明確。課題組前期研究[11-13]已明確了額力根-7能通過調(diào)控Janus激酶2(JAK2)/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT3)、核因子κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(Akt)等信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用,而藍(lán)盆花是該復(fù)方中較為重要的藥材,因此本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探討藍(lán)盆花對PI3K/Akt信號通路的影響,為肝纖維化治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系 SPF級雄性Wistar大鼠20只,體質(zhì)量180～220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006,使用許可證編號:SYXK(蒙)2015-0001,均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫18～22 ℃,自由進(jìn)食、飲水。大鼠HSC-T6購自北京北納科技有限公司。

1.1.2 藥品和主要試劑 藍(lán)盆花購自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)有限責(zé)任公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗-α-SMA、兔抗-Collagen Ⅰ、兔抗-PTEN、兔抗-PI3K、兔抗-Akt、兔抗-p-Akt購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)盆花含藥血清制備 將藍(lán)盆花粉碎過100目篩得到粉末,以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解。20只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組和給藥組,每組10只。對照組以生理鹽水代替藥物,給藥組藍(lán)盆花按成人最低劑量的10倍折算給藥(1 800 mg·kg-1·d-1)[10],兩組均每日灌胃1次。1周后腹主動(dòng)脈取血,靜置20 min,3 000 r/min離心,56 ℃ 30 min滅活,0.22 μm濾膜過濾,得到含藥血清保存于-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HSC-T6細(xì)胞均采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),保存于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁且生長密度達(dá)到80%～90%時(shí),分別加入對照組血清(10%)、藍(lán)盆花含藥血清低劑量組(10%)、藍(lán)盆花含藥血清中劑量組(15%)及藍(lán)盆花含藥血清高劑量組(20%),繼續(xù)上述條件下培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測藍(lán)盆花對HSC的影響 參照碧云天MTT試劑盒說明書。將HSC-T6細(xì)胞配成5×103/mL細(xì)胞懸液,200 μL/孔接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁繼續(xù)培養(yǎng)6 h,棄掉原上清,按上述分組加入不同劑量含藥血清培養(yǎng)液,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h,加入10 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,于酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔OD值并記錄結(jié)果,同時(shí)計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=[(對照組A值-處理組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)]×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測HSC-T6的凋亡率。調(diào)整細(xì)胞密度為5×104～1×105個(gè)/孔(6孔板),用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,離心棄上清,加入195 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞。再分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,避光孵育10～20 min后上機(jī)。

1.2.5 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá) 用Trizol法提取各組細(xì)胞的RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行q-PCR技術(shù)檢測。所有引物均由上海生工設(shè)計(jì)如下,β-actin:F 5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′,R 5′-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3′;α-SMA:F 5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′R 5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCGCAGC-3′;Collagen Ⅰ:F 5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC -3′,R 5′- CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′;PTEN:F 5′-TTGAAGACCATAACCCACCACAGC-3′,R 5′-CATTACACCAGTCCGTCCTTTCCC-3′;PI3K:F 5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3′,R 5′-CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′;Akt:F 5′-CAAGCACCGTGTGACCATGA-3′,R 5′-TCAGTAA-GCGTGTGGGCAAC-3′。所有體系分析均設(shè)3個(gè)重復(fù),結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞的蛋白,所得蛋白樣品95 ℃熱變性5 min,SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜,常溫封閉1 h,兔抗鼠GAPDH(1:20 000)為內(nèi)參,α-SMA(1∶2 500)、Collagen Ⅰ(1∶1 000)、PTEN(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)一抗4 ℃過夜。次日二抗(1∶1 000)常溫1 h后掃膜進(jìn)行灰度值分析。以上實(shí)驗(yàn)步驟獨(dú)立進(jìn)行3次。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)盆花含藥血清對HSC-T6增殖的影響 MTT結(jié)果顯示,與對照組比較,給藥24 h后,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值顯著降低(P值均<0.01),抑制率分別為44.7%、35.23%和77.73%;給藥48 h后,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值顯著降低(P值均<0.01),抑制率分別為34.44%、27.65%、38.89%;給藥72 h后,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值降低(P值均<0.05),抑制率分別為13.02%、16.80%、21.44%(表1)。

表1 各組細(xì)胞OD值的檢測結(jié)果Table 1 Results of OD value of cells in each group

2.2 藍(lán)盆花含藥血清對HSC-T6凋亡的影響 與對照組比較,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組的細(xì)胞總凋亡率均顯著增高(P值均<0.05),且均以早期凋亡率增高為主(圖1,表2)。

圖1 藍(lán)盆花含藥血清各組細(xì)胞凋亡的流式圖Figure 1 The flow chart of cell apoptosis in each group of serum containing blue pot flower

表2 各組細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果Table 2 Detection results of apoptosis rate in each group

2.3 HSC-T6中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt通路mRNA表達(dá)情況 qRT-PCR結(jié)果顯示:與對照組比較,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt mRNA表達(dá)顯著下調(diào),PTEN mRNA表達(dá)顯著增高(P值均<0.05)(表3)。

表3 HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt及PTEN 的mRNA水平Table 3 The mRNA expression levels of α-SMA, Collagen Ⅰ, PI3K, Akt and PTEN in HSC-T6 cells

2.4 HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示:與對照組比較,藍(lán)盆花含藥血清低、中、高劑量組α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào),PTEN蛋白表達(dá)顯著增高(P值均<0.05)(表4,圖2)。

圖2 各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖Figure 2 Electrophoresis plots of Collagen Ⅰ, α-SMA and PI3K/Akt signaling pathway-related protein expression in each group of cells

表4 HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt及PTEN的蛋白表達(dá)水平Table 4 The protein expression levels of α-SMA, Collagen Ⅰ, PI3K, Akt, p-Akt and PTEN in HSC-T6 cells

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病的常見病理基礎(chǔ),若不及時(shí)治療,將會導(dǎo)致疾病進(jìn)一步發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約33%的肝纖維化患者將進(jìn)展為肝硬化,約85%的肝硬化患者被診斷為肝細(xì)胞癌[14]。肝纖維化有多種病因,這些致病因素最終通過炎癥和氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)肝臟發(fā)生纖維化[15]。在纖維化的病理狀態(tài)下,ECM在肝臟損傷處大量分泌和沉積,進(jìn)而破壞肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能[16]。因此,預(yù)防和治療肝纖維化具有重要臨床意義。

肝纖維化常以HSC的激活、遷移和增殖,以及纖維化發(fā)生為特征[17]。激活后的HSC不斷增殖、收縮,上調(diào)ECM成分和ECM修飾酶的合成,還產(chǎn)生促纖維細(xì)胞因子、生長因子和形態(tài)發(fā)生蛋白等,進(jìn)而調(diào)節(jié)和影響組織結(jié)構(gòu)[18]。α-SMA的表達(dá)是識別激活HSC的最突出標(biāo)志物,通過改變細(xì)胞骨架和/或驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、收縮,參與傷口愈合期間的相關(guān)信號傳導(dǎo)過程[19-20]。而激活的HSC產(chǎn)生的纖維生成成分主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白組成,如纖維連接蛋白和蛋白多糖[21]。有大量研究[22-23]表明,在一些促纖維形成介質(zhì)的刺激下,活化的HSC明顯上調(diào)α-SMA和Collagen Ⅰ的表達(dá),使HSC遷移到受損部位,最終導(dǎo)致纖維化不可逆地持續(xù)進(jìn)展。本研究基于前期的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步從細(xì)胞層面對單味藥展開探討,發(fā)現(xiàn)不同劑量的藍(lán)盆花含藥血清能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,藍(lán)盆花各劑量組均不同程度地降低α-SMA和Collagen Ⅰ的mRNA及蛋白的表達(dá)。除此之外,實(shí)驗(yàn)還探討了PI3K/Akt信號通路在肝纖維化中的作用機(jī)制。

PI3K/Akt通路是細(xì)胞周期過程中重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路,它與細(xì)胞靜止、增殖、分化和自噬等有關(guān)。激活的PI3K發(fā)生磷酸化后能激活定位于細(xì)胞膜中的Akt,有助于Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,并進(jìn)一步介導(dǎo)酶生物學(xué)效應(yīng),包括參與細(xì)胞增殖、凋亡抑制、細(xì)胞遷移、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞癌轉(zhuǎn)化效應(yīng)[24]。此外,PI3K/Akt信號通路還接受PTEN的調(diào)控,PTEN是該通路中的主要拮抗劑。PTEN作為3,4,5-三磷酸脂酸肌醇(PIP3)的最常見底物,多通過脫磷酸化反應(yīng)維持PIP3處于低水平狀態(tài),進(jìn)而下調(diào)PI3K/Akt通路表達(dá)[25]。Xiu等[26]和Liu等[27]研究得出,PI3K/Akt通路與ECM積累相關(guān),當(dāng)給予LY294002(PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑)時(shí),PTEN高表達(dá)、Akt(Ser 473、Thr 308)低表達(dá),并減少了結(jié)締組織生長因子、纖連蛋白和膠原蛋白的產(chǎn)生。本研究結(jié)果與上述相一致,在HSC活化過程中,藍(lán)盆花各劑量組PTEN顯著上調(diào),PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)下調(diào),提示藍(lán)盆花的抗肝纖維化與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

綜上所述,藍(lán)盆花能通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路直接或間接改善肝纖維化,促使激活的HSC凋亡,提示它可能是治療肝纖維化的潛在藥物。

倫理學(xué)聲明:本研究方案于2015年3月11日經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科研倫理委員會審批,批號:YKD2015153,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明:顏羽昕、高曉陽負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫論文;張春艷、金蓉參與收集數(shù)據(jù),修改論文;袁宏偉、馬月宏負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。