楊春芬,鐘黎黎,盛 瑩

子癇前期(preeclampsia,PE)是發(fā)生在妊娠20周后的特發(fā)性疾病,伴隨高血壓、蛋白尿、惡心等癥狀,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦妊娠期及圍生兒死亡的主要因素[1]。目前,PE病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有研究[2]表明,在妊娠早期胎盤組織形成初始階段,持續(xù)低氧會致使滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、侵襲能力降低,導(dǎo)致胎盤血管及器官發(fā)育異常,可能是PE病發(fā)的主要因素。miRNA是一類真核生物內(nèi)源性、具有調(diào)控功能的小分子非編碼單鏈RNA,參與不同生物過程的調(diào)節(jié),包括發(fā)育模式、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等過程。miR-130a-3p作為miRNA的一員,在細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(mesenchymal transformation,EMT)等過程中起重要作用。例如,Chen et al[3]研究表明,上調(diào)miR-130a-3p抑制乳腺癌細(xì)胞活性、遷移、侵襲和EMT進(jìn)展。Yang et al[4]研究表明,miR-130a-3p在PE患者胎盤組織中高表達(dá),但具體功能和作用機(jī)制不詳。去乙?；?sirtuin-7,Sitr7)在機(jī)體中發(fā)揮多種調(diào)控作用,如細(xì)胞衰老、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生等。有研究[5]表明,Sitr7能夠保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞免受低氧誘導(dǎo)的損傷和細(xì)胞凋亡。但Sitr7在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)情況以及miR-130a-3p是否可靶向Sitr7調(diào)控PE發(fā)展進(jìn)程,目前還尚未見報道。因此,該研究旨在探討低氧條件下經(jīng)miR-130a-3p靶向Sirt7對人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其作用機(jī)制,為PE的治療提供新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo(美國ATCC公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Sigma公司);Sirt7抑制劑97491(美國Selleck公司);Transwell小室(美國Corning公司);Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司);miR-130a-3p mimics及其陰性對照mimics-NC、miR-130a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC(廣州銳博生物技術(shù)有限公司);Lipofectamine 2000試劑盒(美國Introvigen公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Sirt7抗體、HIF-1α抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、MMP-9抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin 抗體、Vimentin抗體、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HPR)偶聯(lián)的二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);FQD-16A熒光定量PCR儀(杭州博日科技股份有限公司);Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞采用含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d傳代1次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)期HTR-8/SVneo細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度以2×105個/孔接種于6孔板中過夜,待細(xì)胞密度達(dá)70%時,使用Lipofectamine 2000將miR-130a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞中,將細(xì)胞依次分為miR-130a-3p inhibitor組和inhibitor-NC組,另設(shè)置空白對照組(blank),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞處理及分組第1部分實(shí)驗(yàn):探討低氧誘導(dǎo)過程中HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-130a-3p和Sirt7表達(dá)水平,即將HTR-8/SVneo細(xì)胞分為常氧組和低氧組,其中常氧組細(xì)胞采用常氧培養(yǎng)條件(21%O2+5%CO2+74%N2)分別培養(yǎng)12、24、48 h;而低氧組細(xì)胞采用低氧條件(1%O2+5%CO2+94%N2)分別培養(yǎng)12、24、48 h。第2部分實(shí)驗(yàn):探討抑制miR-130a-3p表達(dá)對低氧條件HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響及機(jī)制,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要作如下分組,對照組(Con組):未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)48 h;低氧組(Hyp組):未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)48 h;低氧+inhibitor NC組(Hyp+ inhibitor NC組):轉(zhuǎn)染inhibitor NC的HTR-8/SVneo細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor組(Hyp+inhibitor組):轉(zhuǎn)染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor+Sirt7抑制劑97491組(Hyp+inhibitor +97491組):轉(zhuǎn)染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo細(xì)胞采用10 μmol/L Sirt7抑制劑97491預(yù)處理2 h,再在低氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力取對數(shù)期HTR-8/SVneo細(xì)胞,細(xì)胞密度為2×105個/孔接種于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)70%時進(jìn)行分組處理。收集各組細(xì)胞,使用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/ml,上室加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加入600 μl 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,取出小室,經(jīng)固定、染色、水洗、晾干處理,使用顯微鏡拍照并記錄遷移細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞侵襲:提前在小室中加入50 μl基質(zhì)膠(1 mg/ml)置于培養(yǎng)箱中溫育4 h,其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-130a-3p和Sirt7 mRNA表達(dá)水平分組處理后收集各組細(xì)胞沉淀,使用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA,并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR條件為94 ℃預(yù)變性30 s,94 ℃變性30 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸45 s,擴(kuò)增35個循環(huán)后,72 ℃終末延伸10 min。以U6或GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算miR-130a-3p與Sirt7相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期HTR-8/SVneo細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度以2×105個/孔接種于6孔板中,過夜,按1.4項(xiàng)下第2部分實(shí)驗(yàn)分組處理后收集各組細(xì)胞沉淀,加入RIPA裂解液充分裂解,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白含量。取40 μg蛋白經(jīng)金屬浴煮沸10 min變性,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,加入Sirt7抗體(1 ∶1 000)、HIF-1α抗體(1 ∶1 000)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體(1 ∶1 000)、MMP-9抗體(1 ∶1 000)、E-cadherin抗體(1 ∶1 000)、N-cadherin抗體(1 ∶1 000)、Vimentin抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。洗膜3次后,加入辣根過氧化物酶(HPR)偶聯(lián)的二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h,洗膜3次,滴加ECL顯影液。使用Image J軟件分析待測蛋白的相對GAPDH的表達(dá)水平。

1.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130a-3p與Sirt7靶標(biāo)關(guān)系采用在線miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan Human 7.1預(yù)測miR-130a-3p與Sirt7 基因3′-UTR區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成Sirt7野生型(Sirt7-WT)和Sirt7突變型(Sirt7-Mut)熒光素酶表達(dá)載體,合成相應(yīng)熒光素酶載體質(zhì)粒,使用Lipofectamine 2000將Sirt7-WT、Sirt7-Mut分別與miR-130a-3p mimics、mimics-NC轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后檢測相應(yīng)熒光素酶活性,即螢火蟲熒光素酶的檢測值與海腎熒光素酶檢測值的比值(Firefly Luciferase/Renilla Luciferase)。

2 結(jié)果

2.1 低氧對HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-130a-3p和Sirt7表達(dá)水平影響qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1A)顯示,與常氧組比較,低氧12、24、48 h后低氧組細(xì)胞中miR-130a-3p表達(dá)水平逐漸升高(F=46.295,P<0.001),而Sirt7 mRNA表達(dá)水平逐漸降低(F=75.993,P<0.001)。Western blot結(jié)果(圖1B)顯示,與常氧組比較,低氧12、24、48 h后低氧組細(xì)胞中Sirt7蛋白表達(dá)水平逐漸降低(F=18.152,P<0.001)。

圖1 各組細(xì)胞中miR-130a-3p、Sirt7表達(dá)水平

2.2 抑制miR-130a-3p表達(dá)對低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-130a-3p和Sirt7表達(dá)水平影響qRT-PCR結(jié)果顯示,與blank組比較,miR-130a-3p inhibitor組細(xì)胞中miR-130a-3p表達(dá)水平降低(P<0.05),而inhibitor-NC組無變化(P>0.05),提示miR-130a-3p過表達(dá)的HTR-8/SVneo細(xì)胞構(gòu)建成功,見圖2A。與Con組比較,Hyp組miR-130a-3p水平升高(P<0.05),Sirt7 mRNA水平降低;與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組miR-130a-3p水平降低(P<0.05),Sirt7 mRNA水平升高;與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組miR-130a-3p水平無變化(P>0.05),Sirt7 mRNA水平降低(P<0.05),見圖2B。

圖2 各組細(xì)胞中miR-130a-3p和Sirt7表達(dá)水平

2.3 抑制miR-130a-3p表達(dá)對低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Transwell結(jié)果(圖3)所示,與Con組比較,Hyp組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目減少(P<0.05);與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目增加(P<0.05);與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目減少(P<0.05)。

圖3 抑制miR-130a-3p表達(dá)對低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 ×200

2.4 抑制miR-130a-3p表達(dá)對低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果(圖4)顯示,與Con組比較,Hyp組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05);與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平升高(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05);與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。

圖4 各組細(xì)胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平

2.5 miR-130a-3p靶向Sirt7調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證在線miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan Human 7.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果(圖5A)顯示,Sirt7的3′-UTR中存在與miR-130a-3p互補(bǔ)序列。雙熒光素酶報告結(jié)果(圖5B)顯示,與mimics-NC組比較,miR-130a-3p mimics組與Sirt7-WT組共轉(zhuǎn)染后可以降低其熒光素酶活性[(1.03±0.01)vs(0.24±0.03),P<0.05],而與Sirt7-Mut共轉(zhuǎn)染后對其熒光素酶活性無影響[(1.02±0.01)vs(1.01±0.01),P>0.05]。

圖5 miR-130a-3p靶向Sirt7調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

3 討論

滋養(yǎng)層細(xì)胞維持正常的生理功能是胎盤正常發(fā)育和孕婦正常妊娠的前提。在妊娠早期,胎盤形成初始階段處于相對低氧的環(huán)境,這種環(huán)境可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及血管形成;然而,持續(xù)低氧導(dǎo)致的低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的持續(xù)高表達(dá)會導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常,誘發(fā)與妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,如PE和胎兒生長受限[6-7]。該研究結(jié)果顯示,miR-130a-3p可靶向Sirt調(diào)控HIF-1α進(jìn)而影響低氧條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞HRT-8/SVneo遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

既往研究[8-9]表明,不同miRNA在正常妊娠和PE妊娠的胎盤組織中表達(dá)有所差異,同時這些 miRNA介導(dǎo)的滋養(yǎng)層功能揭示了PE的發(fā)病機(jī)制。miR-130a-3p是miR-130家族成員之一,其調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能已有研究揭示。例如在癌癥研究[10]中,miR-130a-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào),可靶向WNT1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖;然而,胃癌組織和細(xì)胞系中miR-130a-3p水平上調(diào),可通過激活下游信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11];此外,miR-130a-3p 在體外和體內(nèi)均可抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌EC-1細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。目前,關(guān)于miR-130a-3p在PE中作用機(jī)制還尚未見報道。該研究表明miR-130a-3p在低氧誘導(dǎo)的人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo中表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低miR-130a-3p表達(dá)可促進(jìn)低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲,上調(diào)MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平,下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平,說明敲低miR-130a-3p表達(dá)對PE有治療作用。該研究結(jié)果顯示敲低miR-130a-3p表達(dá)可上調(diào)Sirt7蛋白表達(dá)水平,下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)水平。然而,miR-130a-3p與Sirt7的靶向關(guān)系以及Sirt7是否參與HIF-1α的調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。

Sirt7是sirtuin家族中一員,其作為一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,如對于表觀遺傳學(xué)的調(diào)控、維持惡性腫瘤細(xì)胞的表型、調(diào)控腫瘤細(xì)胞的特異性生長、細(xì)胞侵襲以及細(xì)胞轉(zhuǎn)移等腫瘤的生物學(xué)過程[13-14]。HIF-1α是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,參與細(xì)胞增殖、分化、血管形成等多種生理進(jìn)程。Hubbi et al[15]研究表明敲低Sirt7表達(dá)可上調(diào)HeLa、Hep3B、MDA-MB-231和293T細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平。張展 等[16]研究表明,低氧可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3中HIF-1α表達(dá),沉默HIF-1α可抑制其侵襲和遷移能力。然而,Sirt7與HIF-1α在PE發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)系未知。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sirt7在低氧誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)上調(diào)可降低HIF-1α水平,并促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步研究表明,miR-130a-3p inhibitor聯(lián)合Sirt7抑制劑干預(yù)后,可逆轉(zhuǎn)miR-130a-3p低表達(dá)對低氧HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用,并上調(diào)HIF-1α表達(dá)。此外,該研究通過雙熒光素酶報告表明miR-130a-3p與Sirt7之間存在靶向調(diào)控關(guān)系,提示miR-130a-3p靶向Sirt7調(diào)控HIF-1α進(jìn)而影響低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述,敲低miR-130a-3p表達(dá)可促進(jìn)低氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,其機(jī)制可能與靶向調(diào)控Sirt7有關(guān)。該研究可為治療PE提供新的思路,但仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步闡明miR-130a-3p在PE中作用的分子機(jī)制。