于麗娜,羅 珺,李艷秋,劉友林,賈一帆, 趙詩文, 王 偉

(1.大連圣亞海洋生物研究所,遼寧 大連 116023;2.大連海洋大學(xué),遼寧 大連 116023)

巴布亞企鵝(Pygoscelispapua)又名白眉企鵝、金圖企鵝,身長60～80 cm,重約6 kg,眼睛上方有一個明顯的白斑,嘴細(xì)長,嘴角呈紅色,眼角處有一個紅色的三角形,顯得眉清目秀。因其模樣憨態(tài)有趣,有如紳士,十分可愛,因而俗稱“紳士企鵝”,平均壽命為20年。巴布亞企鵝的自然分布數(shù)量正在迅速減少,根據(jù)世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)調(diào)查顯示,巴布亞企鵝的數(shù)量接近近危[1]。為了保護(hù)巴布亞企鵝,遷地保護(hù)成為一種重要的生物資源保護(hù)方式和策略[2],遷地保護(hù)主要是在動物園、水族館中進(jìn)行。2000年我國首次引進(jìn)16只巴布亞企鵝,隨后成功繁殖12只幼企鵝[3]。國外企鵝的遷地保護(hù)比國內(nèi)進(jìn)行得早。1919年,愛丁堡7只王企鵝中的一對成功孵化并養(yǎng)育了一只小企鵝,這是圈養(yǎng)企鵝群首次成功繁殖。本研究通過對巴布亞企鵝精子形態(tài)的觀察,將為企鵝精子形態(tài)學(xué)研究和評價提供素材,也為進(jìn)一步開展巴布亞企鵝人工繁育和遷地保護(hù)工作提供技術(shù)支持。

精子超微結(jié)構(gòu)研究是檢驗精液品質(zhì)、揭示精子發(fā)生機制、開展受精生物學(xué)研究的一項重要內(nèi)容[4]。精子的形態(tài)和品質(zhì)會直接影響穿卵能力和母體的受孕率[5-7],對研究企鵝授精機制、繁殖和種質(zhì)資源庫建設(shè)[8-9],特別是對利用人工繁育保護(hù)瀕危物種的應(yīng)用具有重要意義[10]。巴布亞企鵝精子形態(tài)的掃描電鏡和透射電鏡研究尚未見報道,本研究使用掃描電鏡和透射電鏡對5只正處于繁殖期的巴布亞企鵝精子進(jìn)行形態(tài)觀察,觀察其表面的結(jié)構(gòu),闡明巴布亞企鵝精子的超微結(jié)構(gòu),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及精液的采集

達(dá)到性成熟的雄性巴布亞企鵝5只,來源于大連圣亞旅游控股股份有限公司。其繁育區(qū)陸地面積200 m2,水體體積90 m3,溫度控制在-1～0 ℃,水溫控制在5～8 ℃,光照強度控制在1 500～2 000 lx。

采精前將雄性企鵝單獨在企鵝展廳中進(jìn)行隔離,采精時工作人員一只手抱住企鵝固定身體和翅膀,另一只手握住腿;另一名工作人員對企鵝進(jìn)行刺激,左手撫摸腹部,右手撫摸背部,用脫脂棉輕輕刺激泄殖腔。采集過程中要求無糞便、血液等污染物,采集到的精液立即放入凍存管中,每只雄性企鵝精液采集時間為5～8 min。采集后將雄性企鵝放回繁育區(qū),觀察到人工采精并沒有影響雄性巴布亞企鵝筑巢和配對行為。

1.2 精子掃描電鏡觀察

固定:從凍存管用膠頭滴管小心吸取新鮮精液,此過程中為減少對樣本的機械損傷,要在1～3 min內(nèi)完成取樣,均勻涂布于≤3 mm2組織塊,用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗去除雜質(zhì),并對需要掃描的面進(jìn)行標(biāo)記。迅速投入到掃描電鏡固定液室溫固定2 h,隨后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱中保存。

后固定:采用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)對固定好的精液樣品漂洗3次,每次15 min。并使用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)配制1%鋨酸,室溫下避光固定1～2 h。再次采用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)對精液漂洗3次,每次時長為15 min。

脫水:將樣品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇進(jìn)行梯度脫水,每次15 min;放入100%乙醇脫水30 min;再放入100%乙酸異戊酯置換15 min。

干燥:將巴布亞企鵝精子樣本放入臨界點干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。

樣本導(dǎo)電處理:將企鵝精液樣本放入離子濺射儀樣品臺上噴金30 s左右,此過程精子樣本需緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上。

掃描電子顯微鏡下觀察,進(jìn)行精子圖像分析。

1.3 精子透射電鏡觀察

固定:將新鮮精液吸入離心管內(nèi),放入離心機,以≤3 000 r/min離心2 min,細(xì)胞團要有綠豆大小。去培養(yǎng)基后樣本中加入電鏡固定液,在4 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

瓊脂預(yù)包埋:精液采用離心機<3 000 r/min離心2 min,棄去上清液,加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 值7.4),混勻漂洗3 min后再于<3 000 r/min離心2 min,重復(fù)漂洗3次。提前加熱溶解,制備1%瓊脂糖溶液,稍冷卻后加入EP管內(nèi),在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起,使懸浮物包裹于瓊脂糖內(nèi)。

后固定:使用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)配制1%鋨酸,室溫下進(jìn)行避光固定2 h。采用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.4)對精子樣本漂洗3次,每次15 min。

室溫脫水:樣品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇進(jìn)行梯度脫水,每次20 min;再放入100%乙醇脫水40 min;然后用100%丙酮置換30 min。

滲透與包埋:脫水后樣本采用丙酮∶812包埋劑=1∶1的體積比例,在37 ℃靜置2～4 h;丙酮∶812包埋劑=1∶2的體積比例在37 ℃下靜置開蓋過夜;再用純812包埋劑在37 ℃靜置5～8 h,然后將純812包埋劑倒入包埋板,37 ℃烤箱處理12 h以上。

聚合:將滲透與包埋后的樣品在恒溫箱內(nèi)60 ℃聚合2 d,取出樹脂塊,備用。

超薄切片:用超薄切片機對樹脂塊進(jìn)行切片,厚度為60～80 nm,用150目方華膜銅網(wǎng)撈起,放入培養(yǎng)皿中。

染色:對切片進(jìn)行雙重染色,將銅網(wǎng)放在2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min;用70%乙醇清洗3次;超純水清洗3次;使用2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min;超純水清洗3次,濾紙吸出多余的水分后將銅網(wǎng)切片,放入銅網(wǎng)盒內(nèi),在室溫下進(jìn)行干燥。

透射電子顯微鏡下觀察,對巴布亞企鵝精子進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 企鵝精子的外部形態(tài)

通過掃描電鏡,觀察到巴布亞企鵝精子主要由頭部11.40～11.60 μm(見圖1 A)、中段1.83～2.69 μm(見圖1 B)和尾部47.50～59.74 μm(見圖1 C)組成,屬于典型的鞭毛精子。

2.2 巴布亞企鵝精子的超微結(jié)構(gòu)

通過透射電鏡觀察到巴布亞企鵝精子的頭部長而窄,呈橢球形(見圖2A)。在巴布亞企鵝精子的中段發(fā)現(xiàn)了0.61～0.81 μm自噬體,呈新月形(見圖2B)。巴布亞企鵝精子的尾部細(xì)長,呈鞭毛狀(見圖2C);同時觀察到了9+2微管結(jié)構(gòu),長0.30～0.42 μm,與尾部中心軸平行排列(見圖2D)。

圖1 巴布亞企鵝精子掃描結(jié)果Fig.1 Gentoo penguin sperm scan results

圖2 巴布亞企鵝精子透射結(jié)果Fig.2 Sperm transmission results of Gentoo penguin

3 討論與結(jié)論

本研究中,通過腹部按摩采集企鵝精液的技術(shù),由飼養(yǎng)人員進(jìn)行無創(chuàng)精液樣本采集[11],這使雄性企鵝的壓力和脅迫感降低。通過觀察人工采精行為并沒有影響雄性巴布亞企鵝筑巢和配對行為。

本研究對巴布亞企鵝精子進(jìn)行了掃描電鏡和透射電鏡觀察,經(jīng)掃描電鏡觀察巴布亞企鵝精子與其他動物正常精子的形態(tài)與結(jié)構(gòu)存在著一定的差異,但是都具有相似的結(jié)構(gòu)特點:精子總體能夠分成頭部、中段及尾部,屬于典型的鞭毛精子。目前只有少數(shù)鳥類的精子形態(tài)計量學(xué)數(shù)據(jù),其中記錄最多的是公雞、火雞和鵪鶉[12-14]。本研究觀察到巴布亞企鵝和王企鵝精子的頭部與公雞相似[9],鳥類精子的長度一般總長度為30～300 μm。根據(jù)掃描電鏡和透射電鏡觀察到,巴布亞企鵝精子的頭部呈橢球形,長11.40～11.60 μm;中段較短,長1.83～2.69 μm;尾部細(xì)長,長47.50～59.74 μm。非雀形目鳥類的每個精子組分的尺寸表現(xiàn)出一致性,精子頭部長度在11.57～13.60 μm之間,中段長2.06～3.16 μm,尾部長47.22～53.57 μm[15]。此次研究中巴布亞企鵝精子的形態(tài)學(xué)計量數(shù)據(jù)也在此范圍中,并且通過透射電鏡觀察到巴布亞企鵝精子的超微結(jié)構(gòu),9+2微管結(jié)構(gòu)長0.30～0.42 μm與尾部中心軸平行排列;自噬體呈新月狀,長0.61～0.81 μm。

本研究闡明了巴布亞企鵝精子的超微結(jié)構(gòu),對巴布亞企鵝授精機制、繁殖和種質(zhì)資源庫建設(shè)提供了基礎(chǔ),為有效遏制巴布亞企鵝遺傳多樣性的降低、也為珍稀動物巴布亞企鵝遷地保護(hù)提供技術(shù)支持。