陸禮和，田先嬌，田素梅，馬艷粉，郭云膠，楊新周，3**

（1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.德宏師范高等專科學校 民族醫(yī)藥研究所，云南 芒市 678400；3.德宏師范高等?？茖W校 理工學院，云南 芒市 678400）

胡蜂酒來源于景頗民族醫(yī)藥，由德宏州瑞麗人梅干家族發(fā)明［1］，自1977年以來一直收錄在《中華人民共和國藥典》中。胡蜂酒不僅可以祛除風濕、治療急性風濕病、風濕性關(guān)節(jié)炎，而且對治療肩周炎、坐骨神經(jīng)痛、四肢麻木、跌打損傷都有一定的療效；用法上不僅可以口服，還可以外用［2］。胡蜂酒承載著民族文化和歷史的文化。目前對胡蜂酒的研究主要集中在制作工藝上，對胡蜂酒中薄層色譜和液相指紋圖譜鮮見報道。

《中華人民共和國藥典》中主要記載了胡蜂酒的制法、性狀，檢查項目主要包括pH、乙醇量、總固體物、其他酒劑有關(guān)的各項規(guī)定、功能主治、用法用量等［2］。目前僅有彭增榮對胡蜂酒進行了初步的鑒別［3］，郭云膠等研究了胡蜂酒的配制方法［4］，而對于胡蜂酒指紋圖譜方面的研究較少。

指紋圖譜作為較為完善的藥材評價體系，主要分為色譜、光譜和分子指紋圖譜等［5-8］。薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）是鑒別中藥材的常用方法之一，具有簡便快捷的特點［9-10］，廣泛用于中藥材的鑒別、質(zhì)量控制［11-17］。液相色譜作為目前應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)，具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點［5-8］，已廣泛用于動植物成分分析與鑒別應(yīng)用中［18-25］。本研究以胡蜂酒為研究對象，通過高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）建立指紋圖譜并進行分析，旨在為胡蜂酒的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

實驗用純水為UPR-II優(yōu)普超純水機所制超純水。乙腈、甲酸（色譜純），異硫氰酸苯酯（PITC），三乙胺等其他試劑均為分析純。螞蟻酒（昆明野象谷生物工程開發(fā)有限公司，36%）、蝎子酒（山東蒙山釀酒釀酒有限公司，35%）、蛇酒（永州市異蛇科技有限公司，32%）。

胡蜂收集于云南不同地區(qū)，經(jīng)德宏師專郭云膠教授鑒定為胡蜂科金環(huán)胡蜂（Vespa mandarinia Smith）。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Ultimate 3000，賽默飛世爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 胡蜂酒的制作

按照2020版藥典，稱取100 g鮮胡蜂，加入1000mL白酒，浸泡20 d以上，得胡蜂酒。

1.3.2 薄層色譜鑒定

取胡蜂酒溶液14批，按照薄層色譜法（中國藥典通則0502）試驗，吸取14批胡蜂酒溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。以正丁醇-甲酸（體積比50∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃烘至呈現(xiàn)斑點清晰。

1.3.3 HPLC指紋圖譜研究

1）色譜條件。色譜柱：AgilentC18柱（?4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；檢 測 波 長：254 nm；流 動 相：（A）0.1mol／L乙酸鈉（用乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）-（B）乙腈，梯度見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序

2）供試品溶液的制備。精密移取胡蜂酒2mL，置圓底燒瓶中，60℃ 減壓濃縮干燥，殘渣加0.1mol／L鹽酸溶液10mL溶解，搖勻，備用；精密量取上述供試品溶液各5mL，分別置25mL量瓶中，各加0.1mol／L異硫氰酸苯酯 （PITC）的乙腈溶液2.5mL，1mol／L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10mL，加正己烷10mL，振搖，放置10min，取下層溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3）測定法。分別精密吸取衍生化后的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡蜂酒薄層色譜圖

不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒薄層色譜圖見圖1。其中0號為白酒，1～14號樣品為胡蜂酒，從圖1中看出，胡蜂酒薄層色譜分離度好，斑點清晰。薄層色譜主要為氨基酸薄層色譜，可用于鑒別胡蜂酒。

圖1 胡蜂酒薄層色譜圖

2.2 方法學驗證

色譜圖見圖2。

圖2 樣品色譜圖

2.2.1 精密度試驗

取同一份胡蜂酒樣品 （S1），按 “1.3.3中2）項”制備供試液品，按“1.3.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，以16號色譜峰為參照，其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.38%，相對保留峰面積RSD≤0.41%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗

取胡蜂酒樣品（S1），按“1.3.3中2）項”制備供試液品，按“1.3.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、24、48 h進樣，以12號色譜峰為參照，其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.45%，相對保留峰面積RSD≤0.81%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗

取胡蜂酒樣品（S1），按“1.3.3中2）項”平行制備供試液品6份，按“1.3.3”項下色譜條件測試，檢測指紋圖譜，以12號色譜峰為參照，其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.45%，相對保留峰面積RSD≤0.81%，表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

2.3 指紋圖譜建立及相似度評價

取14批胡蜂酒樣品溶液，按“1.3.3”色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2017版）”，設(shè)定參照圖譜，采用多點校正及譜峰自動匹配，生成14批樣品的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜，見圖3。共確定19個共有峰（見圖2）。

圖3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2017版）進行相似度評價，結(jié)果見表3。14批胡蜂酒樣品的相似度在0.946以上，說明不同產(chǎn)地的胡蜂酒樣品間的化學成分差異較小。

表3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.4 胡蜂酒與其他類型酒的圖譜

用同樣的方法制備HFJ（胡蜂酒）、SJ（蛇酒）、XZJ（蝎子酒）、MYJ（螞蟻酒）樣品溶液，按照“1.3.3”項下色譜條件進行測試，色譜圖見圖4。從圖4中看出，4種動物酒HPLC圖譜既有相似的色譜峰，也存在不同的色譜峰。在16～24min之間，蛇酒未出現(xiàn)色譜峰，蝎子酒出現(xiàn)了一個微弱的色譜峰，螞蟻酒出現(xiàn)色譜峰與胡蜂酒相似，但強度較低，通過液相色譜可以將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進行區(qū)分辨別。導致4種動物酒出現(xiàn)差異可能是化學成分種類和含量之間存在差異。

圖4 胡蜂酒與其他動物酒的HPLC圖譜

2.5 聚類分析

以14個不同產(chǎn)區(qū)，共有色譜峰峰面積進行聚類分析，可將胡蜂酒分為4類。第一類包括S2、S3、S5、S10、S6、S1、S4、S9、S11、S13，第二類包括S7，第三類包括S12、S14，第四類包括S8（見圖5）。

圖5 胡蜂酒峰面積聚類分析

2.6 主成分分析

結(jié)合胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣，計算該矩陣的特征值和方差貢獻率，結(jié)果見表4。確定了4個主成分，其中，第1、2、3、4主成分對總方差的貢獻率分別達到 42.947%、21.263%、13.235%、8.742%。所有研究指標提供信息的85.917%能被前4個主成分反映出來，達到了對不同產(chǎn)地胡蜂酒中共有峰指標評價的降維目的。

表4 相關(guān)系數(shù)特征值和方差貢獻率

將14個不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒中19個共有峰峰面積指標進行因子分析，從而對不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒共有峰峰面積指標進行降維處理。進一步求出矩陣的特征值、特征向量、貢獻率和累計貢獻率（表4）。初始因子載荷矩陣、載荷圖如表5及圖6。從表5和圖6中看出，第1主成分與共有峰G1、G2、G3、G5、G10、G11、G12、G13、G15呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強。第2主成分與共有峰4、6、7、9、14、16、17、18呈正相關(guān)，第3主成分與共有峰19呈正相關(guān)，第4主成分與共有峰G1、G2呈正相關(guān)。根據(jù)19個共有峰在不同因子上的載荷，可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強。

圖6 因子載荷圖

表5 初始因子載荷矩陣

3 結(jié)論

本研究以不同產(chǎn)地胡蜂酒為研究對象，以正丁醇-甲酸作為展開系統(tǒng)，茚三酮試液為顯色劑，建立了胡蜂酒的氨基酸薄層色譜；通過實驗得出，胡蜂酒薄層色譜分離度好，斑點清晰，可用于鑒別胡蜂酒。在液相色譜條件 （Agilent C18（?4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，乙腈-0.1mol／L醋酸鈉溶液為流動相，梯度洗脫，流速為1.0mL／min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃）下，建立了HPLC指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜評價系統(tǒng)進行相似度分析。對共有色譜峰進行聚類分析，可將胡蜂酒分為4類。以胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣，計算該矩陣的特征值和方差貢獻率，確定了4個主成分，根據(jù)19個共有峰在不同因子上的載荷，可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強。通過液相色譜專屬性分析，可將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進行區(qū)分辨別。通過建立的胡蜂酒的TLC鑒別方法和HPLC指紋圖譜，兩種方法簡單、可靠，可用于胡蜂酒的鑒別和質(zhì)量控制。