蘇曉梅 李靜 劉淑梅 呂宏君 王施慧 侯麗霞

摘 ? ?要：為準確高效地鑒定番茄雜交種純度，以美小紅及其父母本為試驗材料，從48對核心InDel標記中挑選3對在雙親中具有明顯差異且條帶清晰的InDel標記，對100個美小紅單株進行純度檢測，并與田間調查結果相比較。結果表明，在3對分子標記檢測結果中，100個雜交種單株中有98個表現(xiàn)為父母本雙親互補的共顯性條帶，2個單株表現(xiàn)為母本類型的條帶，種子純度為98%，上述結果與大田鑒定結果高度一致。因此，利用該方法可準確高效地檢測雜交種純度，節(jié)約檢測成本，縮短檢測時間。

關鍵詞：番茄；美小紅；雜交種；InDel標記；純度鑒定

中圖分類號：S641.2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）06-028-04

Identification of hybrid purity of new tomato variety Meixiaohong by using InDel markers

SU Xiaomei1， LI Jing1，2， LIU Shumei1， L? Hongjun1， WANG Shihui1， HOU Lixia1

（1. Shandong Province Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables/Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， Shandong， China; 2. College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to identify the purity of tomato hybrid seeds accurately and efficiently， Meixiaohong and their parental inbred lines were used to detect the primers polymorphism. From 48 pairs core InDel markers， 3 pairs with clear bands and significant difference in both parents were selected to identify the purity of 100 Meixiaohong individual plants， then compared with the result of field investigation. The identification results were completely consistent by 3 InDel markers. Of the 100 Meixiaohong individuals， 98 plants were amplified the codominant bands of parental inbred lines and 2 plants were amplified the same band as the female parent. Therefore， the seed purity of 'Meixiaohong' reached 98%， which were highly consistent with the result obtained in the field investigation. This method can be used to identify the hybrids purity accurately and quickly， which saves the cost and time greatly.

Key words： Tomato; Meixiaohong; Hybrid; InDel markers; Purity identification

番茄是世界上重要的蔬菜作物，每年全球總產量1.7億t，在蔬菜作物中產量位居首位[1]。番茄種子是全球銷售額最大的蔬菜作物種子，也是國際上競爭最激烈的種子產業(yè)之一。我國是番茄生產大國，產量占全球的三分之一，也是世界上最大的番茄種子市場。目前，生產中的番茄品種大多數(shù)為雜交種，然而在其制種過程中，常會由于去雄不徹底、昆蟲傳粉以及機械混雜等使得雜交種子純度降低，從而影響番茄產量或品質，對生產造成一定損失。雜交種純度作為衡量種子質量的重要指標之一，越來越受到種子生產單位和種植戶的重視。生產中為保證雜交種質量，在種子銷售之前需要對其純度進行鑒定，因此，建立一種高效、準確的雜交種純度鑒定方法至關重要[2]。

傳統(tǒng)的雜交種純度鑒定以田間表型調查為主。這種方法工作量大、易受種植環(huán)境影響且鑒定周期較長，往往需要經(jīng)過一個完整的生長發(fā)育期，從而造成種子銷售滯后，甚至會錯過銷售旺季。近年來，隨著分子生物學的進步，以DNA為基礎的分子標記技術迅猛發(fā)展，農作物雜交種純度的室內分子標記鑒定技術得到快速發(fā)展。DNA分子標記技術已成熟應用于番茄[3]、辣椒[4]、茄子[5]、黃瓜[6]、西瓜[7]、甜瓜[8]、大白菜[9]、甘藍[10]和蘿卜[11]等多種蔬菜的雜交種純度鑒定。

美小紅是山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所番茄課題組選育的優(yōu)質櫻桃番茄新品種。2022年完成非主要農作物品種登記[GPD番茄（2022）370116]。該品種果實為亮紅色卵圓形，口感好，可溶性固形物含量（w）9.5%以上，綜合抗性強，適宜在黃淮海及長江以北等地區(qū)設施內推廣應用。筆者選用100株美小紅及其父母本作為試驗材料，篩選出3對InDel多態(tài)性引物用于美小紅雜交種純度鑒定。結合田間性狀調查結果，明確美小紅的雜交種種子純度。同時，建立高效穩(wěn)定的番茄雜交種純度分子鑒定技術體系，為其他番茄品種純度的快速鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為櫻桃番茄美小紅雜交種及其父母本。2022年2月在山東省濟南市歷城區(qū)唐王育苗基地育苗，其間正常管理。當番茄幼苗生長發(fā)育至6葉1心時，移至日光溫室進行定植。定植后對所有單株進行編號掛牌，便于后續(xù)的分子標記鑒定和田間表型調查。

1.2 番茄基因組DNA提取

采用快速法提取番茄基因組DNA。美小紅雜交種及其父母本定植后，隨機選取父母本各5株，取其幼嫩葉片，獲得父母本各自的混合樣品進行DNA提取。對于雜交種單株，按照田間編號，取其幼嫩葉片進行DNA提取。具體操作步驟如下：將樣品置于2 mL離心管中并加2粒鋯珠，加入500 μL提取液（稱取12.1 g Tris，28.1 g NaCl，18.6 g EDTA，加水溶解并定容至1 L），于自動研磨儀上研磨2 min，然后12 000 r·min-1離心8 min，吸取400 μL上清液至1.5 mL離心管，加等體積異丙醇（或2倍體積冰乙醇）沉淀，-20 ℃放置30 min左右，離心5 min棄上清液，加入500 μL 75%乙醇清洗后倒掉乙醇，晾干后加100 μL ddH2O溶解。所有DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 InDel標記篩選

利用美小紅父母本DNA對48對InDel引物[12]進行多態(tài)性篩選。PCR擴增體系總體積為10 μL：DNA模板2 μL，2×Super Taq PCR Mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，ddH2O補充至10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；16 ℃保存。PCR產物檢測：8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（180 V，2 h 30 min）分離PCR擴增產物。電泳結束后進行銀染，觀察記錄擴增結果。選擇父母本間擴增條帶清晰、有差異且重復性好的引物，用于進一步種子純度鑒定。

1.4 種子純度鑒定

以100個美小紅單株DNA和雙親DNA為模板，用篩選獲得的特異性InDel標記進行PCR擴增，電泳檢測擴增條帶，計算雜交種純度。雜交種純度/%=具有雙親互補條帶的樣本數(shù)/檢測的樣本數(shù)×100。

1.5 田間性狀調查鑒定

2022年3月底，將美小紅及其父母本在日光溫室定植。其中，美小紅種植100株，父母本各種12株，隨后進行常規(guī)的田間管理，并在番茄生長發(fā)育不同時期進行田間性狀調查。在果實成熟后，針對父母本和雜交種間的主要差異性狀，每隔7 d調查1次，共計調查3次，盡量避免環(huán)境因素和人為因素造成的影響。

2 結果與分析

2.1 美小紅純度鑒定的引物篩選

以美小紅父母本DNA為模板，對48對InDel引物進行多態(tài)性篩選。結果顯示，48對引物中，25對引物在親本之間擴增條帶不同，多態(tài)率為52.08%；21對引物在父母本之間擴增出相同條帶，沒有多態(tài)性；還有2對引物未擴增出明顯條帶。在25對多態(tài)性引物中，挑選不同染色體或相同染色體不同位置的在親本間具有明顯差異的3對標記InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33），作為雜交種純度鑒定的引物（圖1，表1）。

2.2 美小紅種子純度的InDel標記分析

利用上述篩選獲得的3對標記InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）對100個美小紅單株進行分子標記純度鑒定。如圖2所示，標記InDel-145（圖2-a）、InDel-242（圖2-b）和InDel-283（圖2-c）鑒定結果一致，在100個F1雜交種單株中，田間單株編號43和56的2個樣本與母本（P1）帶型一樣，其余98個單株均為與父母本雙親互補的雜合帶型，表明該雜交種純度為98%。

2.3 田間農藝性狀調查

在田間進行農藝性狀鑒定時，需要選擇在親本及雜交種中具有明顯差異的且不易受環(huán)境影響的性狀進行區(qū)分鑒定。調查中發(fā)現(xiàn)，相對于父本和美小紅雜交種，母本果實圓形，節(jié)間短，葉色深綠，葉裂深，此性狀可用于區(qū)分父母本和雜交種。調查上述100個美小紅單株發(fā)現(xiàn)98株農藝性狀一致，果實表現(xiàn)為亮紅色卵圓形，而編號43和56的2個單株性狀與母本高度一致，果實為圓形。因此，田間調查顯示美小紅的種子純度為98%，該結果與3對InDel標記鑒定結果吻合。

3 討論與結論

隨著我國番茄種子市場的規(guī)范化管理，番茄種子品質也大幅提升。種子純度是種子質量的重要指標之一，種子純度鑒定是種子生產銷售工作中不可缺少的重要步驟。高效準確的雜交種純度檢測方法對進一步提高種子質量具有重要意義。近年來，以DNA為基礎的分子標記技術迅速發(fā)展，為農作物品種純度鑒定提供了新的技術手段。在DNA分子標記技術中，InDel標記由于其多態(tài)性高、變異穩(wěn)定且檢測容易等優(yōu)點，在種質資源親緣關系鑒定及雜交種純度鑒定等方面具有明顯的優(yōu)勢[13-15]。筆者選用的48對InDel標記均勻分布于番茄12條染色體上，被制定為番茄品種鑒定行業(yè)標準，已應用于番茄種質資源的遺傳多樣性分析及番茄品種真實性鑒定[16]。研究表明，使用2～4對多態(tài)性標記進行雜交種純度鑒定，可以避免因單引物選擇不當或其他異源雜種造成的誤差，從而提高檢測的準確性[4，17]。在本研究篩選的多態(tài)性引物中，雖然第28、29、30、31號引物均在親本間表現(xiàn)多態(tài)且條帶清晰穩(wěn)定，但由于它們均位于11號染色體上，且遺傳連鎖較為緊密，因此在本試驗中并沒有選擇這些標記進行種子純度鑒定。而InDel-242（25）和InDel-283（33）標記同樣位于11號染色體上，但其遺傳距離較遠，可以避免由標記連鎖而導致的鑒定結果相同，從而提高結果的準確性。

利用InDel分子標記技術進行番茄雜交種的純度鑒定，可以替代田間形態(tài)學性狀鑒定法，具有較高的可信度。選用多態(tài)性好且穩(wěn)定的核心標記有利于提高篩選效率，降低成本。本研究結果顯示，48對標記雙親間多態(tài)性可達到52.08%，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的特點，有利于雜交種的純度鑒定。筆者選用InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）標記對100個美小紅單株進行純度檢測，最終結果與田間形態(tài)鑒定結果一致。因此，這3對標記適于櫻桃番茄美小紅雜交種純度鑒定，可為其雜交種生產應用提供科學依據(jù)。

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