孟淑春 劉立功 宋曉玉 宋順華 張峰

摘 ? ?要：種子純度鑒定是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。田間小區(qū)種植鑒定法，周期長、費用高，無法滿足種子貿(mào)易中快速鑒定的要求，且受環(huán)境影響大，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。DNA電泳鑒定技術(shù)為種子的純度鑒定提供了一種更為快速、高效的方法。筆者采用72對SSR引物對黃瓜品種京研冬美9號及其親本進行多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，12對引物在親本間具有多態(tài)性，并都表現(xiàn)出共顯性，在雜交后代中表現(xiàn)為清晰、穩(wěn)定的父母本互補的帶型，特異性強，可以用來區(qū)別其中混雜的母本、父本及其他品種的種子。這12對SSR引物作為京研冬美9號及其親本的核心引物，構(gòu)成的京研冬美9號的SSR指紋圖譜，為京研冬美9號雜交種的親本提純、純度檢測及真實性鑒定等工作提供了有效的技術(shù)支持。其中，2對引物SSR17922和SSR02118特異性強且譜帶清晰，利用這2對引物對京研冬美9號黃瓜種子進行檢測，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，被選為鑒定黃瓜京研冬美9號純度的特異引物。

關(guān)鍵詞：黃瓜；京研冬美9號；SSR；純度鑒定

中圖分類號：S642.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）06-023-05

SSR purity identification of cucumber variety Jingyan Dongmei No. 9

MENG Shuchun1， LIU Ligong1， SONG Xiaoyu1，2， SONG Shunhua1， ZHANG Feng1

（1. State Key Laboratory of Vegetable Biobreeding/National Engineering Research Center for Vegetables/Supervision， Inspection and Test Center of Vegetable Seed Quality of Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Beijing Vegetable Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science， Beijing 100097， China; 2. Horticulture College， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： For increasing the efficiency of application of the variety identification and seed genetic purity on cucumber hybrid seed， ensuring the seed genetic quality， alternative 72 pairs of SSR primers have been applied in the screening the molecular markers on the cucumber Jingyan Dongmei No.9 and their parents. The results showed that 12 pairs of primers complementary to appear polymorphic bands between the parents， clear and stabilized， performing codominance， highly specificity， among hybrids， which can be used to distinct its parents and other varieties. The core SSR primers of Jingyan Dongmei No. 9 were composed mainly of these 12 pairs of primers， formed the SSR fingerprint of Jingyan Dongmei No. 9， which provided technological information for seeds purity， authenticity of hybrid and parents purifying. Among them， the bands amplified by 8 pairs of primers were highly distinguishable， the particularity was strong， as well as the characteristics of clear bands and the result agreed with field test.

Key words： Cucumber; Jingyan Dongmei No. 9; SSR; Purity identification

黃瓜（Cucumis sativus L.）別名胡瓜，是葫蘆科黃瓜屬黃瓜亞屬中的一個種，一年生攀緣性草本植物，染色體數(shù)2n=2x=14，多為雌雄同株，少量其他性型。雄花常數(shù)朵在葉腋簇生；雌花單生或稀簇生。黃瓜果實棒狀、長圓形或圓柱形，嫩果呈綠色、黃色、白色等，富含蛋白質(zhì)、維生素C、尼克酸、胡蘿卜素、鐵、磷、鈣等營養(yǎng)成分。黃瓜通常以嫩果供食用，蒸炒燉煮、涼拌生食或加工腌制皆可。黃瓜的熱量僅67 kJ·100 g-1，是低熱量的蔬菜。黃瓜含有丙醇二酸，又名羥丙二酸，在不妨礙糖類物質(zhì)向人體提供熱量和能量的情況下，能夠抑制糖類在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為脂肪，因此，有減肥健美的功效[1]。黃瓜莖蔓可入藥，能鎮(zhèn)痙、祛痰、消炎，對降血壓、降膽固醇有療效。大約3000年前，印度開始栽培黃瓜，后經(jīng)絲綢之路傳入中國，到公元1500年前后，西班牙、加拿大先后有了黃瓜的種植記錄，到公元1600年左右，黃瓜已經(jīng)在世界各地廣泛種植。在長期栽培選擇和自然演化過程中，形成了豐富多樣的栽培類型和黃瓜品種，現(xiàn)廣泛種植于溫帶和熱帶及亞熱帶地區(qū)，成為世界主要蔬菜之一。因為黃瓜不同品種和類型的生態(tài)適應(yīng)性不同，特性、特征也存在很大差異，所以各地都有適合當(dāng)?shù)貧夂蚝蜕鷳B(tài)條件以及消費習(xí)慣的品種。隨著人民生活水平的提高，以及在保護地生產(chǎn)中的高效益使黃瓜的保護地栽培迅速發(fā)展，黃瓜生長期延長，經(jīng)濟效益明顯提高，成為中國各地周年供應(yīng)的主要蔬菜之一。

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，育種手段不斷更新，育種水平不斷提高，我國蔬菜優(yōu)新品種數(shù)量急劇增加，但是品種侵權(quán)、品種套牌的現(xiàn)象仍然普遍存在、屢禁不止，給種子生產(chǎn)銷售和農(nóng)民增收帶來巨大損失的同時，也嚴(yán)重損害了正規(guī)種子企業(yè)的切身利益[2-3]。品種純度是優(yōu)良品種的遺傳特性得以充分體現(xiàn)、種子遺傳質(zhì)量得到保證的前提，是種子質(zhì)量評價和評定種子等級的重要指標(biāo)[3]，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)都有較大的影響，在種子生產(chǎn)、加工、貯藏及銷售過程中具有重要意義和應(yīng)用價值。由于在種子的制種過程中很容易出現(xiàn)生物學(xué)混雜、機械混雜等情況，再加上不法商販的人為摻假，導(dǎo)致種子的品種純度和真實性受到嚴(yán)重影響。因此，在銷售使用前有必要對種子的真?zhèn)魏推贩N純度進行抽樣檢測。目前，在生產(chǎn)上應(yīng)用最為廣泛的田間小區(qū)種植鑒定方法，簡單、直觀、便于觀察，但是由于植株的很多形態(tài)學(xué)性狀表現(xiàn)常常受環(huán)境條件的影響，尤其是一些數(shù)量性狀在不同的栽培條件下會產(chǎn)生很大差異，對鑒定人員的技術(shù)水平要求非常高，生產(chǎn)用種的純度鑒定往往只能異地加代檢測，所需周期長、時效性差、成本高[4]。近年來，生物技術(shù)實現(xiàn)了日新月異的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記在種子真?zhèn)魏图兌辱b定領(lǐng)域取得較大的進展，其優(yōu)點主要表現(xiàn)為：鑒定品種準(zhǔn)確可靠、可鑒定表型難于鑒別的品種；試驗周期短、成本較低、便于實現(xiàn)自動化；鑒定過程不受環(huán)境因素影響。目前已經(jīng)在一些主要蔬菜和主要農(nóng)作物上取得良好效果，其中，SSR標(biāo)記技術(shù)操作步驟簡便、試驗結(jié)果可靠[5]，廣泛地應(yīng)用于玉米[6]、小麥[7]、水稻[8]、棉花[9]、甘藍[10]、大白菜[11]等多種作物上。近年來，在黃瓜品種純度鑒定[12-15]、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[16-20]、重要基因定位[21-23]等方面得到廣泛應(yīng)用。

京研冬美9號是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所黃瓜開發(fā)課題組最新育成的雜交一代黃瓜品種。其雌花節(jié)率較高、早熟，植株生長勢較強，不易早衰，全生育期120 d左右。主蔓結(jié)瓜型，瓜條順直，膨瓜速度快，瓜長35 cm左右，把短，外皮深綠，有光澤，刺瘤適中，瓤色淺綠，風(fēng)味濃，肉質(zhì)脆，適宜冬、春保護地種植。使用優(yōu)質(zhì)的黃瓜砧木嫁接育苗，可提高植株抗逆性，增加果實亮度及延長收獲期。為確保商品種質(zhì)量，現(xiàn)以京研冬美9號父本、母本以及F1為材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選多態(tài)性豐富的SSR引物，進行京研冬美9號商品種子的純度鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

京研冬美9號黃瓜F1雜交種及其父本、母本，均為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所培育品種。

1.2 DNA提取

試驗于2021年10月在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所品種純度分子鑒定實驗室進行。從凈種子中隨機數(shù)取400粒種子，每100粒為1個重復(fù)，重復(fù)4次，置于紙床發(fā)芽，種苗長到2.5 cm左右，采用經(jīng)過改良的CTAB法提取種苗基因組DNA[18]。

1.3 特異性條帶篩選

以京研冬美9號父本、母本及其F1雜交種的種苗基因組DNA為模板，采用72對SSR引物，引物來自李海梅[24]和Huang等[25]，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。用ddH2O分別配制上游引物、下游引物濃度均為100 μmol·L-1的儲存液，再進一步用超純水稀釋成10 μmol·L-1的工作液。利用PCR技術(shù)對重復(fù)序列進行擴增，PCR反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體積20.0 μL，其中包括10 mmol·L-1 dNTP 0.4 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 2.0 μL，10 pmol·L-1正反引物各1.0 μL，ddH2O補齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，35循環(huán)；72 ℃ 4 min，于4 ℃保存。

擴增結(jié)束后，采用2.5%高分辨率瓊脂糖進行電泳，在電泳過程中，PCR產(chǎn)物在電場作用下得到分離。電泳后將瓊脂糖凝膠置于GBOX-CHEMIXRQ智能成像分析系統(tǒng)中采集圖像，根據(jù)PCR產(chǎn)物的帶型差異，選擇雜交種既具有父本帶型又具有母本帶型，即父母本互補型的引物，進一步進行個體檢測。

1.4 田間小區(qū)種植

從凈種子中隨機數(shù)取800粒種子，直播于制種基地8家農(nóng)戶大棚，每戶種植100粒，四周設(shè)保護行，平均行距75 cm、株距30 cm，田間管理按常規(guī)進行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

一般情況下，品種純度以百分率表示。將所鑒定的本品種、異品種、異作物和雜草等均以所鑒定植株的百分率表示。品種純度結(jié)果可采用以下公式計算：

品種純度/%=[本作物的總株數(shù)-變異株數(shù)（非典型株數(shù)）]/本作物的總株數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性條帶的篩選

應(yīng)用72對SSR引物對黃瓜新品種京研冬美9號父本、母本和F1的基因組DNA進行PCR擴增，通過對其SSR帶型篩選分析，每對引物擴增的位點為1～3個，片段大小介于150～330 bp之間，大部分位點集中在180～250 bp之間。擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示親本和F1之間在12個位點上具有多態(tài)性，雜種后代兼具父本和母本的帶型特征，表現(xiàn)出共顯性分離，具有互補性，可以用來鑒定雜交種的純度。其中，8對引物擴增的多態(tài)性片段帶型清晰、片段分子質(zhì)量差大于10 bp，亮度接近，便于區(qū)分，分別是SSR30495、SSR17922、SSR07131、SSR02118、SSR19998、SSR17406、SSR05748、SSR19918（表1、圖1和圖2）。另外4對引物SSR05723、SSR20079、SSR10348、SSR20286，雖然可以擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性片段，但是帶型模糊、亮度較低，或者多態(tài)性片段的分子質(zhì)量之間小于10 bp，電泳距離較短的時候難以辨識。

2.2 SSR純度鑒定

在存在共顯性分離的12對產(chǎn)生特異性分子標(biāo)記的SSR引物當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)2對引物SSR17922和SSR02118特異性強且譜帶清晰，被選為鑒定黃瓜京研冬美9號純度的特異引物。利用引物SSR17922和SSR02118對來自制種基地8家農(nóng)戶生產(chǎn)的黃瓜京研冬美9號雜交種各隨機選取100個單株進行SSR純度鑒定。電泳結(jié)果顯示，6家農(nóng)戶生產(chǎn)的京研冬美9號雜交種純度為100%（圖3～4），1家農(nóng)戶生產(chǎn)的雜交種純度為99%，1家農(nóng)戶生產(chǎn)的雜交種純度為98%，該批次種子純度為99.6%。田間性狀鑒定結(jié)果顯示，3株假雜種主要農(nóng)藝性狀與母本性狀一致，為母本自交種，田間鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記檢測結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

品種純度鑒定不僅是種子銷售前不可或缺的重要環(huán)節(jié)，而且在種子生產(chǎn)、品種登記管理、品種權(quán)保護、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究中具有重要應(yīng)用價值。目前，我國在黃瓜種子市場中還存在竊取親本異地繁種、套牌上市等問題。此外，在良種生產(chǎn)繁育、采后加工處理、種子貯藏運輸?shù)拳h(huán)節(jié)由管理疏漏所導(dǎo)致的品種混雜、品種純度偏低等種子質(zhì)量問題也比較嚴(yán)重，給農(nóng)戶造成極大的經(jīng)濟損失，育種家、繁種者和種子經(jīng)銷商也都承受承擔(dān)了巨大的經(jīng)濟賠償和心理壓力。每年采收的新種子在出庫銷售之前，都需要抽取一定量的樣品進行品種純度分子鑒定，以確保商品種子的遺傳質(zhì)量[26]。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對種子、幼苗或者植株的品種純度和品種真實性進行分子鑒定是最為有效的方法之一。由于DNA分子標(biāo)記鑒定具有多位點性、高變異性、簡單而穩(wěn)定的遺傳性，目前已經(jīng)被國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV，International Union for the Protection of New Varieties of Plants）納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容。DNA指紋圖譜鑒定在試驗方法和技術(shù)水平上一直不斷的改進、完善和更新?lián)Q代，也會在不遠的將來發(fā)展成為中國農(nóng)作物品種質(zhì)量監(jiān)控的重要措施之一。

筆者研究中發(fā)現(xiàn)的12對SSR標(biāo)記在京研冬美9號父本、母本、F1的PCR擴增圖譜中呈共顯性，構(gòu)成了京研冬美9號親本和F1的指紋圖譜。核心引物SSR30495、SSR17922、SSR07131、SSR02118、SSR19998、SSR17406、SSR05748、SSR19918擴增出的條帶穩(wěn)定性好、清晰度高，多態(tài)性片段分子質(zhì)量差距大于10 bp，易于區(qū)分識別，SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果吻合，為京研冬美9號品種純度、品種真實性鑒定提供了便捷、準(zhǔn)確、高效的鑒定方法，完全可以替代田間種植鑒定以避免資源浪費、節(jié)約土地和人力物力。京研冬美9號SSR指紋圖譜不僅可以為該品種的審定、保護和親本提純提供技術(shù)支持，還可以用于該品種種子批次的快速純度鑒定和品種真實性檢測，并為其相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀和表型特征的基因定位、遺傳圖譜繪制分析提供基礎(chǔ)信息，為同類型華北耐寒型黃瓜品種純度鑒定和真實性檢測提供備選標(biāo)記。自黃瓜新品種京研冬美9號育成銷售開始就采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進行室內(nèi)品種純度分子鑒定工作，同時進行田間種植純度鑒定輔助比對驗證，2020年9月至今2年間累計使用SSR技術(shù)檢測京研冬美9號商品種1200 kg以上，從采種到銷售的時間大大縮短，節(jié)約了資源、提高了效率。

通過比對京研冬美9號種子的室內(nèi)SSR分子標(biāo)記鑒定和田間種植檢測分析，發(fā)現(xiàn)在對種子進行純度鑒定時，田間種植與分子標(biāo)記的結(jié)果吻合度高，在統(tǒng)計上未顯示明顯的差異。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)替代田間種植純度鑒定，不僅不受氣候、溫度、土壤等環(huán)境條件的限制，還能夠提高品種鑒定的高效性和準(zhǔn)確度[14]，同時避免了田間鑒定環(huán)節(jié)繁瑣、用時長、對環(huán)境條件要求高等缺點[3-4，6]，大大提高了時效性，從而確保優(yōu)良品種能夠及時投放市場。SSR分布于黃瓜整個基因組的不同位置上，在每個位點上不同品種重復(fù)單位的數(shù)目及序列可能不同，因而形成片段長度多態(tài)性[27]。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定黃瓜雜交種純度時，揭示的是黃瓜基因組DNA序列的多態(tài)性，因此SSR引物選用的越多，鑒定結(jié)果的可靠性越高，但相應(yīng)的成本也越高[4，28]。在實際制種生產(chǎn)中，黃瓜雜交種的混雜主要來源于制種過程中的母本自交及非父本花粉的雜交，所以黃瓜雜交種的純度鑒定主要在于鑒別是否同時含有雙親血緣（條帶），因此選用1對共顯性SSR引物就可以達到鑒別雜種或者親本的目的，從而達到節(jié)省人力物力、省時高效的目的。

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