蘇國釗 李嬡嬡 陳宇華 韓貝貝 武星廷 鄧超 徐振江

摘 ? ?要：我國苦瓜品種資源較豐富，南北各地均有分布與栽培，多見于南方各省市?？喙螪NA分子標(biāo)記研究開展相對較晚，標(biāo)記類型應(yīng)用較少，分子標(biāo)記輔助育種成果鮮有報道?？偨Y(jié)了RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP及SNP等第二代和第三代DNA分子標(biāo)記在苦瓜品種和種子純度鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位等方面的研究進展，以期為苦瓜遺傳育種等研究提供參考依據(jù)。同時在苦瓜現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上進行展望，認(rèn)為應(yīng)加快挖掘功能性基因，開發(fā)功能性分子標(biāo)記及全基因組SNP芯片，這對后續(xù)研究具有重大意義。

關(guān)鍵詞：苦瓜；品種資源；DNA分子標(biāo)記

中圖分類號：S642.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1673-2871（2023）06-010-06

Research progress on DNA molecular marker of bitter melon

SU Guozhao1，2， LI Aiai2， CHEN Yuhua3， HAN Beibei2， WU Xingting2， DENG Chao2， XU Zhenjiang1

（1. College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， Guangdong， China; 2. Development Center of Science and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100176， China; 3. Crop Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， Fujian， China）

Abstract： China is rich in variety resources of bitter melon. This vegetable is distributed all over the country， mostly in the southern part. The research on DNA molecular markers of bitter melon started relatively late. The types of DNA marker applied in bitter melon are few， and the application of marker-assisted breeding are rarely reported. Here we summarized the research progress and applications of the second and the third generation of DNA makers， such as RAPD， AFLP， SSR， ISSR， SRAP and SNP， in variety and seed purity identification， genetic relationship analysis， genetic map construction， QTL mapping in bitter melon. Based on these information， it is expected that the exploration of functional genes， development of functional molecular markers and whole-genome SNP chips should be accelerated.

Key words： Bitter melon; Variety resources; DNA molecular markers

DNA分子標(biāo)記指DNA水平的遺傳標(biāo)記，可反映物種整個基因組的遺傳多樣性。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)不斷發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種[1]。從1980年Botstein創(chuàng)立第一代基于分子雜交的標(biāo)記RFLP（restriction fragment length polymorphism）[2]，到第二代基于DNA片段PCR擴增的分子標(biāo)記RAPD（random amplified polymorphism DNA）[3]、AFLP（amplified fragment length polymorphism）[4]、SSR（simple sequence repeat）[5]、ISSR（inter simple sequence repeat）[6]、SRAP（sequence-related amplified polymorphism）[7]，再到基于高通量測序的第三代分子標(biāo)記SNP（single nucleotide polymorphism）[8]等，各類分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用在作物種質(zhì)鑒定[9]、種子純度鑒定[10]、遺傳多樣性分析[11]、重要農(nóng)藝性狀QTL定位[12]等方面。

苦瓜屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica charantia L.），廣泛分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，我國最早見于明代朱橚編撰的《救荒本草》。其味苦性寒，具有清熱解暑、清心明目、降血糖、降血壓等重要功能[13]，是我國重要的藥食兩用蔬菜。筆者介紹了國內(nèi)苦瓜品種資源分布情況，綜述了RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等多種DNA分子標(biāo)記在苦瓜品種和種子純度鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等方面的應(yīng)用，以期為苦瓜分子輔助育種、種質(zhì)資源保護和利用等提供參考。

1 品種資源概況與分布

關(guān)于苦瓜的起源，學(xué)界尚未定論。有認(rèn)為苦瓜起源于非洲[14]，并在亞洲經(jīng)過了長久馴化；也有認(rèn)為苦瓜起源于印度及東南亞等地區(qū)[15-16]。根據(jù)果實的表型特征，可將苦瓜分為不同類型[17]：例如，基于瓜形分為大頂瓜和非大頂瓜；對于非大頂瓜，可根據(jù)表皮瘤狀突起特征分為油瓜和珍珠瓜（前者存在從頂部到尾部的完整長棱，后者不存在完整長棱）（圖1）。我國具有較為豐富的苦瓜種質(zhì)資源，全國各地均有栽培?！吨袊卟似贩N志》（2001年）收錄51個苦瓜品種，《中國蔬菜品種資源目錄》第一冊與第二冊（1992年與1998年）共收錄182個苦瓜品種。中國種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺（http：//202.127.42.145/bigdataNew/home/index）顯示，截至2022年底，生產(chǎn)經(jīng)營備案的苦瓜商品品種有300余個（表1），申請新品種權(quán)的苦瓜品種有158個。此外，還有部分近年來文獻(xiàn)報道及各?。ㄊ校┩ㄟ^審（認(rèn)/鑒）定的新品種[18]，多見于南方福建、廣東和四川，以及北方山東、遼寧和北京等地。國內(nèi)已有多家科研單位和企業(yè)致力于苦瓜新品種選育，培育出了一系列苦瓜新品種。

2 苦瓜DNA分子標(biāo)記研究進展

苦瓜DNA分子標(biāo)記的研究開展相對較晚，主要是第二代和第三代分子標(biāo)記，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等，多應(yīng)用于苦瓜品種鑒定、雜交種純度鑒定、遺傳相似性分析等方面。

2.1 RAPD分子標(biāo)記

RAPD是最早基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記[3，19]，該技術(shù)通過任意核苷酸序列的單引物擴增隨機DNA片段，具有廣泛性和種間通用的特點。RAPD標(biāo)記已被應(yīng)用于苦瓜遺傳多樣性分析、雜交種純度鑒定和遺傳變異分析等方面。高山等[20]采用10對RAPD引物將38份苦瓜材料聚類為3個類群6組，與以瓜瘤性狀分類的結(jié)果相近。張少平等[21]從52對RAPD引物中獲得1對引物，可區(qū)分如玉5號雜交種與其父本機械性混雜的假雜交種子。TRIVEDI等[22]利用RAPD分子標(biāo)記對誘變后的苦瓜材料進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘變后的苦瓜材料形態(tài)學(xué)產(chǎn)生變化，引物多態(tài)性亦有所提高。

2.2 AFLP分子標(biāo)記

AFLP技術(shù)從基因組中擴增限制性片段，不僅克服了RFLP信息量少、穩(wěn)定性差、標(biāo)記呈顯隱性等缺點，還具有更高的可靠性和重現(xiàn)性[23]。在苦瓜遺傳多樣性研究中表現(xiàn)出多態(tài)性較好的特點，并且在品種鑒定中也呈現(xiàn)出一定效果。YAN等[24]采用8對AFLP引物在36個苦瓜品種中擴增出992個多態(tài)性條帶，每對引物多態(tài)性條帶占比82%～89%。BEHERA等[25]使用RAPD、ISSR和AFLP標(biāo)記對苦瓜品種進行遺傳多樣性分析，AFLP標(biāo)記也表現(xiàn)出多態(tài)性較高、位點較多的優(yōu)點。此外，有研究者利用AFLP標(biāo)記有效區(qū)分苦瓜高抗和低抗枯萎病品種[26]。

2.3 SSR分子標(biāo)記

SSR分子標(biāo)記又稱微衛(wèi)星標(biāo)記，廣泛分布于基因組中，其起始DNA數(shù)量少，易被PCR檢測和擴增，具有可重復(fù)性強、多態(tài)性好等特點[27]，在苦瓜品種與種子純度鑒定、親緣關(guān)系分析中有較好應(yīng)用。王國莉等[28]使用8對SSR引物在11份苦瓜材料中擴增條帶860條，多態(tài)性條帶占比68.0%，3對SSR引物組合可區(qū)分11個苦瓜品種。SSR標(biāo)記區(qū)分能力較強，可以區(qū)分親緣關(guān)系緊密的品種[29]。姚春鵬等[30]發(fā)掘出2對SSR引物，可將雜交種長綠2號與其父母本區(qū)分開，并可用于種子純度鑒定。SSR標(biāo)記在地理起源明顯差異的苦瓜材料中表現(xiàn)出良好的親緣關(guān)系分析結(jié)果。DHILLON等[31]研究表明，來自亞洲的114份苦瓜品種能被50個SSR標(biāo)記聚為5個類群，分別來源于印度、孟加拉國和巴基斯坦，柬埔寨、越南、印度尼西亞和菲律賓，老撾和泰國，斯里蘭卡，中國臺灣。CUI等[32]使用21對SSR引物將世界各地的212個苦瓜品系聚類為3類，來自拉丁美洲、坦桑尼亞、南亞和中國等地的大部分樣本被區(qū)分開。利用SSR標(biāo)記多等位性質(zhì)和共顯性遺傳等特點，可以檢測苦瓜中的等位變異數(shù)量，例如，李光光等[33]使用16對引物在50份苦瓜品種資源中共檢測出90個等位變異。有研究者對苦瓜SSR標(biāo)記種間通用性進行了驗證，發(fā)現(xiàn)基于苦瓜種基因文庫設(shè)計的40對SSR引物可應(yīng)用到同屬的其他6個種間進行擴增[34]。另外，崔竣杰等[35]基于SSR標(biāo)記和表型性狀構(gòu)建了34份苦瓜核心種質(zhì)，可以提高育種家對種質(zhì)資源的利用效率。以上研究結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記不僅多態(tài)性好，能在一定程度上反映地理起源差異，而且具有一定的種間穿梭性[36]，是鑒定苦瓜品種、構(gòu)建指紋圖譜的有效分子標(biāo)記技術(shù)。

2.4 ISSR分子標(biāo)記

ISSR作為SSR的延伸，以隨機微衛(wèi)星序列為錨定引物，簡化了引物設(shè)計程序。KARAMAN等[37]對12個不同基因型的苦瓜品種進行分子和表型分析，15個ISSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果與果實長度和直徑、葉長等表型特征的分類結(jié)果相近。在苦瓜雜交種純度鑒定中，陳龍正等[38]使用2對ISSR引物可區(qū)分F1代和母本，以及父本機械性混雜。此外，有研究者使用ISSR標(biāo)記對引起苦瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌進行研究[39]，為苦瓜抗枯萎病育種提供了參考價值。ISSR引物設(shè)計不需要基因組信息，但PCR擴增反應(yīng)的最適條件較為嚴(yán)格，亦有前人對苦瓜ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化[40]，為苦瓜ISSR標(biāo)記提供參考。ISSR標(biāo)記在苦瓜種質(zhì)中的研究相對較少，可加快ISSR在苦瓜品種資源評價、遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析及遺傳圖譜構(gòu)建等方面的應(yīng)用。

2.5 SRAP分子標(biāo)記

SRAP標(biāo)記利用獨特引物對基因的特定區(qū)域進行擴增，無需序列信息，在第二代分子標(biāo)記技術(shù)中，具有簡單、高效、重復(fù)性好等特點[41]?？喙献鳛楫惢ㄊ诜圩魑?，雜種優(yōu)勢明顯。在雜種優(yōu)勢分子預(yù)測方面，吳立東等[42]利用SRAP標(biāo)記發(fā)現(xiàn)雙親間遺傳距離與第一雌花節(jié)位雜種優(yōu)勢呈顯著負(fù)相關(guān)，認(rèn)為可應(yīng)用SRAP標(biāo)記預(yù)測第一雌花節(jié)位的雜種優(yōu)勢。在遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中，趙秀娟等[43]采用61對引物將43份苦瓜品種資源分為野生種與半栽培種，以及栽培種。張景云等[44]利用33對SRAP引物結(jié)合14對SSR引物將46份苦瓜材料分為地理分布差異明顯的4個類群，第1類群以江西品種為主，第2類群主要是廣東品種，第3類群主要包含湖南和江西品種，第4類群主要是廣東和臺灣品種。前人使用SRAP標(biāo)記對48份苦瓜自交系進行聚類分析，認(rèn)為控制瓜瘤和瓜色的基因間存在某種程度的連鎖[45]。以上研究結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記在苦瓜品種資源評價中表現(xiàn)出良好效果，可應(yīng)用性較強。

2.6 SNP分子標(biāo)記

SNP是基于基因組上單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，屬于第三代分子標(biāo)記。其數(shù)量大，多態(tài)性豐富，在苦瓜白粉病分子標(biāo)記[46-47]以及α-苦瓜素基因[48]研究中已有相關(guān)結(jié)果。此外，苦瓜遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，MAP30基因與瓜長和瓜刺2個重要農(nóng)藝性狀連鎖，編碼區(qū)存在2個SNP位點[49]，可作為區(qū)分野生種和栽培種的重要分子標(biāo)記?？喙匣閱涡曰ǎ鶕?jù)雌花數(shù)量比例，可將苦瓜分為全雌系（雌花率100%）、強雌系（雌花率在80%以上）[50]和弱雌系，使用全雌系或強雌系作為雜交種母本，有助于降低制種成本、簡化制種程序，雌花數(shù)量多也有利于提高產(chǎn)量。周利娟[51]研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜全雌性狀由隱性單基因控制，基于全基因組重測序，在81個SNP位點中成功檢測出11個位點與全雌性基因連鎖。與重要性狀相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記開發(fā)，有助于克服基因重組導(dǎo)致標(biāo)記與表型檢測不符的缺點[52]。在品種鑒別方面，SNP位點密度大，基于高通量SNP標(biāo)記結(jié)合表型進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，能有效提升分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的可靠性。

3 基于遺傳標(biāo)記的苦瓜QTL定位研究進展

利用DNA分子標(biāo)記構(gòu)建苦瓜高密度遺傳連鎖圖譜有助于重要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)基因的定位，為基因結(jié)構(gòu)和功能研究及分子標(biāo)記輔助育種提供信息。劉子記等[53]對苦瓜遺傳圖譜構(gòu)建現(xiàn)狀進行綜述得出結(jié)論：基于一代、二代分子標(biāo)記構(gòu)建的苦瓜遺傳連鎖圖譜主要采用SRAP和AFLP分子標(biāo)記。近年來，以其他分子標(biāo)記構(gòu)建苦瓜遺傳圖譜及QTL定位的研究相繼報道。例如，彭家柱[54]構(gòu)建苦瓜InDel遺傳圖譜，含有164個InDel標(biāo)記，包括15個連鎖群，并將第1雄花節(jié)位的調(diào)控位點通過QTL定位于連鎖群LG8上。CUI等[55]利用SNP標(biāo)記對苦瓜性別比例、第1雌花節(jié)位和首次出現(xiàn)雌花的時間進行QTL基因定位，共檢測到4個QTL，2個與性別比例相關(guān)的QTL位于第1條染色體，1個與第1雌花節(jié)位相關(guān)的QTL位于第4條染色體，1個與首次出現(xiàn)雌花的天數(shù)相關(guān)的QTL位于第10條染色體。另外，控制苦瓜第1雄花節(jié)位的QTL位于第1條染色體，與第1雌花節(jié)位的QTL在不同染色體上，表明苦瓜雌、雄始花節(jié)位由不同的遺傳位點控制[56]?；赟NP定位QTL的研究逐漸深入，有利于SNP標(biāo)記與田間表型鑒定數(shù)據(jù)結(jié)合。多個重要農(nóng)藝性狀QTL定位成功，有助于深入研究苦瓜各基因效應(yīng)和調(diào)控機制，對促進苦瓜基因工程育種具有重要參考價值。

4 展 望

我國苦瓜品種資源豐富、分布廣泛，利用多種DNA分子標(biāo)記對苦瓜品種資源的研究逐漸深入，各分子標(biāo)記體系逐漸完善，為苦瓜種質(zhì)新資源開發(fā)奠定了堅實基礎(chǔ)?？喙线z傳育種在葫蘆科瓜類作物中相對落后[57-58]，分子標(biāo)記育種成果鮮有報道，需加快利用DNA分子標(biāo)記挖掘和鑒定與農(nóng)藝性狀相關(guān)的功能基因，開發(fā)功能性分子標(biāo)記，加強苦瓜分子輔助育種?？喙先蚪M數(shù)據(jù)已有3個版本[59-60]，國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）收錄苦瓜23 934個基因，其中包括蛋白編碼基因、偽基因和未知功能的基因等。以上基因數(shù)據(jù)和全基因組測序數(shù)據(jù)可為苦瓜分子標(biāo)記開發(fā)、應(yīng)用提供參考和借鑒。此外，開發(fā)苦瓜全基因組SNP芯片，對苦瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、指紋分析、品種純度和真實性鑒定、遺傳背景分析、農(nóng)藝性狀重要基因QTL定位等具有重要意義。

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