張高山,蔣青青,陳 敏,羅 琳

0 引言

隨著全球老齡化的加劇,惡性腫瘤的社會經(jīng)濟負擔也在逐年增加[1]。2020年全球新發(fā)癌癥病例數(shù)約為19 292 789例[2]。腫瘤細胞的主要特征是增殖不受控制、對凋亡有抵抗、轉移、逃避免疫監(jiān)視等[3]。由活性氧(Reactive oxygen species,ROS)引起的高水平氧化應激也是癌細胞的主要特征之一[4]。Keap1 (Kelch-like ECH associated protein)/Nrf2 (NFE2 p45-related factor 2)/ARE (Antioxidant response element,抗氧化反應元件)信號通路在保護細胞免受氧化應激損傷中起著核心作用,是細胞抵抗氧化性損傷的主要途徑之一[5],且被認為是細胞存活的主要防御機制和調(diào)節(jié)因子[6]。Nrf2可以通過結合Notch1啟動子區(qū)的ARE序列和p53抑制劑MDM2(Mouse double minute 2)而誘導惡性腫瘤[7]。p21作為p53直接調(diào)控的靶基因,其抗細胞凋亡功能與致癌特性有關。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)p53及其靶蛋白p21的表達能增加Nrf2和p53之間的相互作用,而p53和p21的敲除則降低了抗氧化和凋亡因子的表達水平[8],可能會穩(wěn)定Nrf2的表達。但Nrf2與p53/p21在腫瘤中的作用有待深入研究[8-10],本文就Nrf2與p53/p21信號通路之間相互調(diào)控作用進行綜述。

1 Keap1/Nrf2/ARE信號通路

1.1 Nrf2結構與調(diào)控 Nrf2/Keap1通路是一種遺傳防御系統(tǒng),提供對多種應激源的保護,包括氧化應激和化學應激[5]。Nrf2屬于堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈轉錄因子的帽“n”環(huán)亞家族[5],其擁有7個保守的Nrf2-ECH同源(Neh)結構域(見圖1),它們具有不同的功能。Neh1結構域中包含堿性亮氨酸鏈(Basic leucine zipper,bZip)與小分子肌腱纖維瘤蛋白(Muscle aponeurotic fibrosarcoma protein,Maf)[11];Neh2結構域包含2個ETGE和DLG基序,它們特異性結合Keap1的結構域,介導Nrf2泛素化和降解[11];C末端Neh3結構域是轉錄激活結構域[10];Neh4和Neh5可通過與cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)相互作用支持轉錄激活,該蛋白具有組蛋白乙酰轉移酶活性[10];Neh6結構域富含絲氨酸殘基,并包含2個β-轉導素重復序列包含蛋白(β-TrCP) DSGIS和DSAPGS,參與Nrf2降解[12-13];Neh7結構域與視黃酸X受體α (Retinoid X receptor α,RXRα)相互作用,抑制Nrf2的細胞保護活性[14]。

圖1 Nrf2、Keap1結構示意圖

正常生理條件下,Nrf2與富含半胱氨酸的蛋白Keap 1結合,通過清選蛋白3(Cullin 3,CUL3)的E3連接酶促進其泛素化,并通過泛素-蛋白酶體途徑促進其降解[15-16]。然而,當受到氧化作用產(chǎn)生應激時,Keap1的活性半胱氨酸殘基就會被修飾,Nrf2從Keap1釋放,并進一步轉移到細胞核,通過與靶基因調(diào)控區(qū)的ARE結合,觸發(fā)細胞的細胞保護[15-16]。

Nrf2/Keap1通路調(diào)控多種細胞保護和解毒酶的基因表達,在維持氧化還原細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[17]。事實上,Nrf2的靶基因通過激活和產(chǎn)生不同的蛋白質、酶和谷胱甘肽、調(diào)節(jié)藥物轉運以及代謝基因和轉錄因子的活性而參與抗氧化活性[18]。因此,Nrf2激活劑和抑制劑可用于治療多種疾病。

1.2 Nrf2與腫瘤的關系 癌變過程的3個主要階段包括：起始、促進和發(fā)展[19]。氧化應激在癌癥發(fā)生和發(fā)展中均具有關鍵作用[20-21]。氧化應激產(chǎn)生的水平以及持續(xù)的時間可能導致腫瘤的形成或嚴重的細胞損傷和細胞死亡[22]。Nrf2/Keap1信號通路是調(diào)節(jié)氧化應激的關鍵分子[5],因此,目前干擾Keap1/Nrf2/ARE通路已經(jīng)成為一種潛在的預防和治療癌癥的策略[23]。研究表明,在較低的穩(wěn)態(tài)水平下,Nrf2能消除ROS、致癌物和其他DNA損傷劑,從而抑制腫瘤的發(fā)生和轉移[24]。但Nrf2/Keap1信號通路的激活并非對所有腫瘤都是有利的[20]。在不同類型的癌癥中,Nrf2活性的增加可能有助于惡性腫瘤細胞抵御過度的氧化應激、化療藥物和放射治療,其機制可能與體細胞突變、Keap1與Nrf2的結合中斷、癌細胞中Nrf2過度激活有關[16,25-26]。此外,Nrf2還通過激活促進增殖相關的細胞保護基因來避免腫瘤細胞凋亡[27]。因此,研究與Nrf2相關的抗腫瘤藥物時,必須慎重考慮Nrf2在癌癥中的雙重作用[23]。

1.3 p53/p21信號通路

1.3.1 p53結構及功能 p53蛋白由393個氨基酸組成,主要有4個功能域：轉錄區(qū)、DNA結合區(qū)、四聚區(qū)和調(diào)控區(qū)[28]。該蛋白由5個保守區(qū)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)和環(huán)狀螺旋結構(L、S、H)組成。環(huán)狀結構域與高度保守的結構域重疊,是蛋白質三維結構的一部分[27]。

p53抑制腫瘤最重要的途徑是誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯[29]。細胞周期停滯可以通過消耗細胞周期進程所需的調(diào)節(jié)蛋白來實現(xiàn)。在p53激活后,許多中樞細胞周期蛋白的基因被轉錄下調(diào)。p53誘導后被抑制的基因包括細胞周期蛋白A[30]、polo樣激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)[30]、細胞周期蛋白B1[31]、細胞周期蛋白B2[32]、細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin dependent kinase 1,CDK1)[33]、細胞分裂周期蛋白20(Cell division cycle 20,CDC20)[32]。對這些不同基因的選擇性,表明p53依賴的表達下調(diào)會影響細胞周期調(diào)控的許多方面。

p53屬于一種雙向轉錄因子,即野生型的p53可以促進細胞凋亡,而突變型的p53可以抑制細胞凋亡,影響分子基礎p53的凋亡可能取決于細胞類型和p53蛋白水平[34]。

1.3.2 p21結構及功能 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21,是一種含有165個氨基酸的小蛋白質,屬于CDKs抑制劑的CIP/KIP(CDK interacting protein/Kinase inhibition protein)家族[35]。p21不僅是一種細胞周期抑制劑、衰老誘導劑和腫瘤抑制劑,還是一種更復雜和更廣泛的調(diào)節(jié)劑[36]。其在誘導凋亡、分化、多功能干細胞的重編程、DNA修復、轉錄和細胞遷移中具有十分關鍵的作用[37]。p21對于G2/M過渡和有絲分裂進程是重要的,它的缺失會導致有絲分裂缺陷,并可能導致基因組不穩(wěn)定[38]。p21誘導在癌細胞增殖和腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮了重要作用[39]。細胞質的p21有利于抗凋亡活性[40],而細胞核的p21與細胞周期停滯有關[41]。所以,區(qū)分p21是致癌蛋白還是腫瘤抑制因子,取決于其在細胞質還是細胞核中[42]。

p21的關鍵調(diào)節(jié)因子是p53,其在控制細胞周期進程、分化、DNA修復和細胞凋亡的過程中起重要作用[43]。目前,針對p21位置和p53蛋白條件導致p21作用不同的觀點存在爭議[44]。

1.3.3 p53與p21的相互關系 研究表明,p53和p21都能對氧化應激產(chǎn)生反應,p21表達受p53依賴性和p53非依賴性機制的調(diào)控。p53誘導p21的表達,以響應細胞應激,例如DNA損傷。在p53轉錄因子活性的影響下,一方面,p21誘導可通過抑制細胞周期蛋白激酶復合物、增殖細胞核抗原 (Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、轉錄因子和共激活因子導致腫瘤生長停滯[45];另一方面,p21可以通過減緩 DNA 損傷的積累來促進腫瘤向癌癥發(fā)展[46]。而正常組織發(fā)育過程中,p21不依賴于p53,其可以通過血清誘導直接進行細胞分化[47]。

1.4 Nrf2信號通路與p53/p21信號通路相互調(diào)控對腫瘤的作用 在功能水平上,p53和Nrf2發(fā)揮著相似的作用,都能增強細胞減輕氧化應激的能力。研究結果表明,p21作為p53靶基因,通過與Keap1結合并干擾其促進Nrf2泛素化和蛋白酶體降解來穩(wěn)定Nrf2表達[48]。NAD(P)H醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)作為Nrf2的靶標,與p53相互作用并阻止其被20S蛋白酶體降解[8],而該降解過程與MDM2和泛素化無關[49]?；诖?研究者提出：Nrf2和p53之間是否存在正反饋環(huán),以及癌細胞是否利用這一正反饋環(huán)來增強其對氧化應激的抵抗力。p53缺失的HCT116結腸癌細胞在受到氧化應激攻擊后,表現(xiàn)出對Nrf2靶基因的誘導減少[50],表明p53可能在腫瘤細胞Nrf2的激活中起重要作用。但是,這個模型可能不完整,因為MDM2也是Nrf2的轉錄靶點,Nrf2通過該靶點負調(diào)控p53[51]。在另一項研究中,p53與Nrf2激活的啟動子元件結合,因此,p53可能也是Nrf2靶基因的轉錄抑制因子[52](見圖2)。有研究者將p53對Nrf2的調(diào)節(jié)總結為2個階段：第一階段是低水平的p53誘導p21,第二階段則是當存在嚴重DNA損傷和p53的高表達時,其會抑制Nrf2介導的存活反應并誘導細胞死亡[53]。綜上,Nrf2和p53之間的確切關系很可能依賴于細胞和生物學環(huán)境。

p21調(diào)節(jié)細胞周期、細胞分化、衰老和凋亡等多種細胞過程[43]。對于氧化應激,p21被上調(diào)以促進細胞存活[54]。然而,具體的p21保護細胞免受氧化損傷的潛在機制仍不明確。有研究者提出分子和遺傳證據(jù),表明氧化應激下,p21依賴性細胞存活是通過激活Nrf2信號通路介導的[55]。通過p21和Nrf2之間的直接相互作用,p21上調(diào)Nrf2的蛋白質水平[55]。在p21敲除時,基礎和誘導的Nrf2轉錄激活效率顯著降低,而在p21高表達時Nrf2活性增加。此外,使用p21缺陷小鼠的相關試驗也證實p21介導Nrf2在基礎和誘導條件下的調(diào)節(jié)[55]。p21在增強Nrf2活化中的作用不僅為其ROS保護作用提供了簡單的解釋[56],更重要的是通過ROS和氧化還原穩(wěn)態(tài)的細胞保護途徑來擴大p53的存活功能[54]。如果ROS水平影響p53介導的細胞狀態(tài),那么Nrf2可能在這個過程中起關鍵作用。

圖2 Nrf2、p53作用示意圖

綜上,Nrf2表達上調(diào)是一把雙刃劍,可抑制化學致癌作用,也可以增加癌細胞存活率并促進耐藥性[57]。這一特點可通過癌癥細胞突變來說明,而癌細胞突變恰好位于Keap1和Nrf2調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi),并引起Nrf2組成型激活。鑒于p21的Nrf2依賴性促存活作用,應當針對p53/p21的突變和功能狀態(tài),進一步評估與Keap1/Nrf2相關的癌癥體細胞突變來尋找相關治療藥物。

2 與Nrf2信號通路和p53/p21信號通路相關的腫瘤治療藥物

2.1 槲皮素 槲皮素是膳食植物(如蘋果、洋蔥、櫻桃等[58])中發(fā)現(xiàn)的黃酮,具有抗炎、抗糖尿病、抗肥胖和抗癌活性[59]。槲皮素通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化應激活性[60]。

有報道,槲皮素可以靶向抗凋亡激酶和選擇性癌基因(如Mcl-1、Ras、MEK和PI3K)或上調(diào)腫瘤抑制基因(p53、p21),從而導致選擇性消除癌細胞[61]。槲皮素可通過抑制肝癌細胞(HepG2)中的RNA降解和蛋白質泛素化來激活和穩(wěn)定p53,從而促進p21表達和細胞周期蛋白D1抑制,有利于細胞周期停滯[62]。

2.2 雷公藤內(nèi)酯 雷公藤內(nèi)酯是雷神藤中天然的二萜類化合物,其能夠誘導有毒的細胞效應,如在肝細胞系中誘導Nrf2及其靶基因[63]。雷公藤內(nèi)酯能夠減少線粒體呼吸,上調(diào)Nrf2及其靶基因HO-1和NQO1[63]。通過靶向p53/p21和BCL-2途徑,該化合物在癌癥中誘導細胞凋亡和細胞周期停滯[64]。相反,在耐藥性髓細胞白血病細胞系中,雷公藤內(nèi)酯通過下調(diào)Nrf2及其靶基因來增強對多柔比星和伊馬替尼誘導的細胞凋亡的敏感性[65]。

2.3 木犀草素 木犀草素是一種來自蔬菜、水果和草藥的膳食黃酮,具有抗炎、抗過敏、抗癌和抗氧化等有益作用,可預防退行性疾病[66-67]。其通過抑制轉錄因子、激酶修飾、細胞周期停滯和誘導凋亡來抑制癌癥的發(fā)生[68]。木犀草素上調(diào)p53及其靶蛋白p21的表達,并增加Nrf2和p53之間的相互作用,從而增加了抗氧化酶和凋亡相關蛋白的表達[8]。

2.4 姜黃素 姜黃素是從姜黃植物的根中提取的多酚,具有抗氧化、抗凋亡和抗炎的特性[69]。其可激活Nrf2途徑,觸發(fā)細胞抗氧化損傷保護,在晚期癌癥中,抗氧化損傷可誘導化學抗性[70]。另一方面,姜黃素可能通過自噬誘導突變型p53降解或將突變型p53蛋白轉化為轉錄活性的野生型p53,逆轉治療耐藥性并促進癌細胞死亡[71-72]。

2.5 大豆抗毒素 大豆抗毒素是一組植物抗毒素,屬于異戊烯化的黃酮類化合物,是大豆中存在的最重要的生物活性化合物,在暴露于某些真菌和一些非生物誘導劑(如紫外線、氯化鋁或茉莉酸甲酯)時存在[73-74]。有研究表明,其可誘導Nrf2信號通路,參與致癌物質的解毒和ROS的去除,在調(diào)節(jié)人類結腸癌小鼠異種移植模型中的腫瘤發(fā)展和生長的過程中存在一定的劑量相關性,即低劑量的大豆抗毒素對腫瘤生長沒有影響,而高劑量的大豆抗毒素可能通過激活 Nrf2介導的信號轉導途徑促進p53野生型結腸癌的生長[75]。

3 結語

腫瘤的發(fā)病機制涉及氧化應激,防御氧化應激反應的重要信號通路 Nrf2/ARE通路在腫瘤的治療中起著至關重要的作用,然而,Nrf2在晚期癌細胞中的構成性激活可能會產(chǎn)生耐藥性。同時p53/p21作為重要的抑癌基因與細胞周期抑制因子,對腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展都具有“雙重作用”,對細胞的凋亡以及分化的控制也起到了非常重要的作用。研究表明,Nrf2通路和p53/p21通路間可能存在相互調(diào)節(jié),而且均參與了很多具有臨床應用價值的天然藥物的抗腫瘤作用機制,但是這兩條通路之間具體的作用機制尚不明確。因此,探索Nrf2與p53/p21相互調(diào)控從而開發(fā)新型防治腫瘤的藥物越來越受到重視。