馮詩涵,崔亞玲,高 歡,劉 彤,許子華,趙慶春*

0 引言

白癜風是一種典型的色素脫失性疾病,全球的患病率為0.1%～8.0%,臨床表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)白斑,對患者造成嚴重的心理打擊,進而導致生活質量下降,患有精神疾病的可能性大大增加[1]。白癜風疾病的發(fā)病機制尚不明確,研究認為,其患病與自身免疫、氧化應激、黑色素細胞自毀、遺傳等多方面功能障礙相關,上述因素導致黑色素細胞破壞,最終使患者皮膚色素脫失[2]。目前,臨床上治療白癜風的方法很多,包括口服藥物治療(中成藥、左旋咪唑)、光療(紅外線、PUVA)、外科手術治療、脫色、中西藥聯(lián)合治療等。中醫(yī)治療白癜風與其他方法相比,臨床應用經驗豐富、療效確切、復發(fā)率低、藥材來源豐富、成本較低、毒副作用小,具有廣闊的發(fā)展前景[3]。

川歸膠囊由川芎、當歸、補骨脂及白鮮皮組成。本方結合白癜風的發(fā)病機制,選以活血散瘀、清熱涼血、疏肝理氣、燥濕解毒、祛風通絡之藥來疏通經絡,去除肌膚毛孔之閉塞,散其行于肌膚瘀滯,標本同治,臨床治療白癜風具有一定的療效,但川歸膠囊的藥效物質基礎及作用機制尚不明確。本研究主要通過網絡藥理學篩選其藥效核心成分、靶點及通路,并對其治療白癜風的作用機制進行探討,將篩選出的核心成分阿魏酸進行定性定量研究,建立川歸膠囊的質量標準,以保證臨床用藥安全、有效、質量可控。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津SPD-20AT),硅膠G薄層板 (青島海洋化工廠分廠),玻璃點樣毛細管(華西醫(yī)科大學儀器廠生產),紫外線分析儀(SHIMADZU UV-2201),電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1.2 試劑 川歸膠囊(規(guī)格：0.3 g/粒,北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自制,批號：20201201、20201208、20201214),川芎對照藥材(四川省維克奇生物科技有限公司,批號：ycwkq21052404),當歸對照藥材(中檢所,批號：120927-201516),乙醚(天津市科密歐化學試劑有限公司),乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司),正己烷-乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司),十八烷基硅烷鍵合硅膠(Shimmer-pack C18),醋酸溶液(天津市科密歐化學試劑有限公司),阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號：0773-9910),甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司),水為純化水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 網絡藥理學預測分析

2.1.1 川歸膠囊活性成分篩選及靶點預測 通過中藥數(shù)據(jù)庫ETCM (http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php),分別以“補骨脂”、“白鮮皮”、“川芎”、“當歸”為關鍵詞,獲取川歸膠囊的活性成分及其對應靶點信息,檢索時間為2022年4月15日。分別收集到補骨脂、白鮮皮、川芎、當歸的18、6、32、31個活性成分,合并去重后共得到77個活性成分,352個作用靶點。如圖1所示。

2.1.2 白癜風疾病相關靶點的預測 在GeneCard(http：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫、OMIM(https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中以“Vitiligo”為關鍵詞檢索白癜風的疾病靶點,檢索時間為2022年4月24日。合并去重后共得到1 192個白癜風疾病的相關靶點。將疾病靶點與成分靶點信息映射構建維恩圖,取交集共得到50個潛在靶點,結果見圖2。

2.1.3 中藥-活性成分-靶點網絡構建及分析 將川歸膠囊中中藥、活性成分以及靶點導入到Cytoscape 3.9.1(https：//cytoscope.org/),構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖,見圖3。采用軟件分析功能計算網絡中節(jié)點的拓撲參數(shù),以各個節(jié)點的自由度值(Degree)為主要評估標準,節(jié)點自由度值越大在網絡圖中則越重要。

取前10的節(jié)點,分別為二十四烷酸、阿魏酸、亞油酸、豆甾醇、肉豆蔻酸、補骨脂異黃酮、孕烯醇酮、菜油甾醇、谷甾醇、花翠素,作為川歸膠囊治療白癜風的核心成分。

圖2 川歸膠囊與白癜風靶點的維恩圖

圖3 川歸膠囊中藥-成分-靶點網絡圖

2.1.4 交集靶點蛋白互作網絡的構建 將得到的藥物與疾病共有的潛在治療靶標信息輸入String(http：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,物種設定為“Homo Sapiens”,得到川歸膠囊治療白癜風疾病潛在治療靶點的PPI網絡圖。將得到的String數(shù)據(jù)庫初始PPI網絡圖導入Cytoscape軟件進行優(yōu)化處理,刪除孤立節(jié)點和連邊后,共有48個節(jié)點,262條邊,從拓撲分析參數(shù)得到ALB、AKT1、TNF、INS、IL-6、ESR1、TP53、IL-1β的自由度值遠大于其他節(jié)點,故認為該8個靶點可能是川歸膠囊治療白癜風的關鍵靶點。結果見圖4、圖5。

2.1.5 基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 將50個白癜風疾病與成分的交集靶點輸入到DAVID平臺(https：//david.ncifcrf.gov/),以P≤0.05為篩選條件,進行GO分析和KEGG分析。GO分析得到共計806個條目。其中,生物學過程(BP)得到734個,主要涉及對激素水平的調節(jié),炎癥反應和細胞對脂質的反應等;分子功能(MF)得到56個,涉及氧化還原酶活性、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性等;細胞組成(CC)得到16個,主要涉及分泌顆粒腔、轉錄復合體、受體復合物等。KEGG分析共得到123條信號通路,主要富集在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、酪氨酸代謝、NOD樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、TNF信號通路等。見圖6、圖7。

圖4 川歸膠囊治療白癜風作用靶點PPI網絡

圖5 關鍵靶點PPI網絡圖

2.2 川歸膠囊質量標準研究 川歸膠囊為中藥復方制劑,君藥川芎和當歸含量較高的主要活性成分為阿魏酸,因此,在質量標準中選用阿魏酸作為質量控制指標。

2.2.1 川芎、當歸的鑒別 取本品粉末1 g,加乙醚20 ml,加熱回流1 h,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯3 ml使溶解,作為供試品溶液。再取川芎、當歸對照藥材各0.5 g,同法制成混合對照藥材溶液。再取按處方比例制成的缺川芎、當歸的陰性樣品1 g,同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述供試品溶液與對照藥材溶液各2 μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性對照無干擾。結果見圖8。

圖6 川歸膠囊治療白癜風潛在靶點的GO富集分析

圖7 川歸膠囊治療白癜風潛在靶點的KEGG信號通路分析

2.2.2 含量測定 ①色譜條件。色譜柱：Welchrom C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相：甲醇(A)-1%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0～30 min,25%～30%A;30～45 min,30%～50%A);柱溫：35 ℃;檢測波長：323 nm;流速：1.0 ml/min;進樣體積：10 μl。

圖8 川芎、當歸的薄層色譜

②溶液配制。對照品溶液的制備：取阿魏酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每l ml含18 μg阿魏酸的對照品溶液。供試品溶液的制備：取川歸膠囊0.6 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇溶液30 ml,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。陰性樣品溶液的制備：按處方取除川芎、當歸外的藥材,按照制備工藝制成川歸膠囊陰性樣品,按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

③專屬性試驗。分別精密吸取陰性樣品溶液、供試品溶液、對照品溶液各10 μl,按“2.2.2”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。由圖9可知,陰性對照樣品不干擾阿魏酸的測定,阿魏酸與其他成分或雜質的分離度均大于1.5,表明此法專屬性強。

圖9 專屬性HPLC圖

④線性關系考察。取阿魏酸對照品適量,精密稱定,用甲醇配制成濃度分別為1.77、3.54、8.84、17.68、35.36、70.72 μg/ml的對照品溶液。精密吸取上述濃度的對照品溶液各10 μl,按“2.2.2”項下色譜條件測定,測定各自峰面積,以對照品的濃度(μg/ml)為橫坐標,峰面積值為縱坐標,求得回歸方程Y=57 401X-82 248,r=0.999 9。結果表明,阿魏酸在濃度為1.77～70.72 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

⑤精密度試驗。精密吸取對照品溶液10 μl,按“2.2.2”項下色譜條件分析,連續(xù)進樣6次,記錄色譜峰的峰面積。測得峰面積值的RSD為0.72%(n=6),≤2%,符合要求。

⑥穩(wěn)定性試驗。取同一批(批號：20200820)樣品,取約0.6 g,精密稱定,按“2.2.2”項制備供試品溶液,按“2.2.2”色譜條件分析,分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣,測定樣品中阿魏酸峰面積。峰面積值的RSD為2.50%(n=7),說明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

⑦重復性試驗。取同一批(批號：20200820)樣品,取約0.6 g(共6份),精密稱定,按“2.2.2”項制備供試品溶液,按“2.2.2”色譜條件分析,測定每份樣品中阿魏酸的含量。結果顯示,樣品中阿魏酸平均含量為0.48 mg/g,RSD為2.32%(n=6),符合要求。

⑧回收率試驗。取同一批(批號：20200820)樣品,每份取約0.3 g(共6份),精密稱定,分別精密加入10 μl阿魏酸對照品溶液(19.68 μg/ml),稱定重量,按“2.2.2”項制備供試品溶液,按“2.2.2”色譜條件分析,測定樣品中含量,計算回收率。結果顯示,平均回收率為102.06%,RSD為1.96%(n=6),符合要求,結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=6)

⑨樣品測定。取3批次川歸膠囊樣品,按“2.2.2”項制備供試品溶液,按“2.2.2”色譜條件分析,測定各自樣品中阿魏酸的含量,結果見表2。3批川歸膠囊中阿魏酸的平均含量為0.102 7 mg/粒。

表2 3批樣品含量測定結果(n=2)

3 討論

中醫(yī)藥理論認為,白癜風主要與氣血瘀滯、風邪致病、肝腎不足、內熱感邪學說相關[4]。中藥復方制劑通常具有通過多個組分、多個靶點、多個通路來發(fā)揮治療疾病作用的特點,使其對疾病作用機制的研究復雜。本研究通過對川歸膠囊活性成分以及對應靶點的篩選,探討川歸膠囊治療白癜風的關鍵作用基因和通路。

通過川歸膠囊與白癜風疾病交集靶點的PPI網絡表明,ALB、AKT1、TNF、INS、IL-6、ESR1、TP53、IL-1β在川歸膠囊治療白癜風疾病中發(fā)揮重要作用。TP53(細胞腫瘤抗原P53)蛋白可以使白癜風患者避免受到光化損傷,改變黑色素細胞遷移能力,從而改善患者色素沉著[5]。白細胞介素會影響黑色素細胞的生理作用,導致體內黑色素作用異常[6],進而使患者患病。白癜風患者血液中IL-6水平增加將使免疫成分匯集到皮膚,導致黑色素細胞被靶向破壞,IL-6就可以解決這個問題。AKT1是RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可以抑制β連環(huán)素的降解,導致小眼癥相關轉錄因子(MITF)和酪氨酸酶被激活,從而促進黑色素合成[7]。TNF可通過各種途徑誘導人黑色素細胞凋亡[8],因此在白癜風的治療中可應用TNF拮抗劑。這些結果表明,川歸膠囊可以從不同層面解決白癜風疾病相關因素的異常,從而達到治療白癜風的目的。

KEGG富集分析結果表明,川歸膠囊治療白癜風可以由多條不同的通路共同完成,主要富集在腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路等。腫瘤壞死因子 (TNF-α)是一種多向性的促炎性單核細胞因子,主要由單核細胞和巨噬細胞產生,能夠起到激活角質形成其他炎癥介質的作用[9],能夠抑制黑色素細胞的增生及黑色素生成,影響黑色素細胞的凋亡,同時參與白癜風發(fā)病的免疫調控[10]。PI3K在持續(xù)活化的同時,能抑制黑色素細胞產生凋亡,在一定程度上加快了黑色素細胞發(fā)生凋亡的速度。所以,在氧化應激誘導的黑色素細胞損傷中,PI3K-Akt信號通路起到了重要作用。中藥網絡藥理學以系統(tǒng)生物學、網絡信息學、生物信息學等多個學科理論為基礎,將生物分子間復雜的相互作用和疾病相關靶點相關聯(lián),構建中藥成分或組分-靶點-疾病相關生物分子網絡模型,進而闡述藥物與機體的作用機制,具有整體性、系統(tǒng)性、動態(tài)性特點,倡導多靶點、多途徑的藥物分析和評價原則,與傳統(tǒng)中醫(yī)中藥診斷和治療疾病的原理殊途同歸。近年來,網絡藥理學在中藥研究中具有長足發(fā)展,可用于預測中藥作用靶點、預測與辨識中藥活性成分群、闡明中藥作用機制、科學解釋組方的規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新的適應證等[11-12]。然而,網絡藥理學對中藥化學成分、基因靶點和信號通路的選擇主要依賴于對文獻和公共數(shù)據(jù)庫的分析,缺乏針對性,且缺少對“量”的考量,忽略了藥物的量效關系,無法體現(xiàn)出各有效成分含量上的差異。將所有成分同等對待,研究其可能的作用靶標和作用機制存在一定的不合理性。因此,為了提高結果的可靠性,課題組將針對核心成分和靶點進行后續(xù)的研究驗證。

本文通過網絡藥理學系統(tǒng)分析可知,二十四烷酸、阿魏酸、亞油酸、豆甾醇、肉豆蔻酸、補骨脂異黃酮、孕烯醇酮、菜油甾醇、谷甾醇、花翠素是川歸膠囊治療白癜風的主要活性化合物。研究發(fā)現(xiàn),阿魏酸能夠通過調控Nrf2/HO-1信號通路、PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路和抑制NF-κB/TNF-α軸發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[13-15]。補骨脂異黃酮通過降低pro-caspase-1自我剪切活化,從而降低NLRP3、NLRC4、AIM2炎癥小體的活性,進一步抑制免疫炎癥反應[16]。豆甾醇通過調節(jié)MAPK3和PRKACA的表達水平,在一定程度上發(fā)揮抗炎作用[17]。

能發(fā)揮活血、行氣、祛風和止痛等功效[18],而當歸性味為甘、溫、辛,具有補血活血、抗炎和增強免疫等功效[19],二者為臨床上常用的配伍藥材。近年來國內外有關川芎和當歸的研究日漸深入,發(fā)現(xiàn)川芎中化學成分主要有揮發(fā)油(如藁本內酯、3-丁基苯酞)、生物堿(如川芎嗪、川芎堿B)、有機酸(如棕櫚酸和阿魏酸)、多糖等,對心腦血管系統(tǒng)、肝腎系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等都具有多方面的藥理活性,主要表現(xiàn)為鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化能力、抗衰老、細胞保護、改善心功能等作用[20-23]。從當歸中分離出的化學成分主要包括揮發(fā)油、有機酸類、多糖以及黃酮等。阿魏酸是有機酸類的代表,是當歸質量控制的重要指標之一。當歸對造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均有良好的藥理作用[24-25]。

川芎、當歸在多系統(tǒng)、多器官及多種疾病的臨床治療中具有重要意義,且二者共同的有效成分主要為阿魏酸。目前,關于含有川芎或當歸的制劑以阿魏酸為質控成分的含量測定較多[26-28],且多數(shù)為高效液相等度洗脫,但因川歸膠囊為中藥復方制劑,供試品溶液經制備后所得到的成分較多,等度洗脫無法使阿魏酸達到基線分離,因此,該研究中的含量測定方法采用梯度洗脫,經多次摸索后確定了梯度洗脫的程序。該方法簡單準確、穩(wěn)定可靠,可用于川歸膠囊的質量評價。

本研究以網絡藥理學篩選的核心成分—阿魏酸作為川歸膠囊質量標準中新的指標成分,建立了阿魏酸的薄層色譜鑒別方法和HPLC含量測定方法。該方法具有較好的專屬性和重現(xiàn)性,提升了川歸膠囊的質量標準,為川歸膠囊的臨床應用和后期醫(yī)院制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。