王江波,梁 皓*,陸允平

0 引言

肺癌(Lung cancer,LC)是一種發(fā)病率和死亡率都極高的惡性腫瘤[1-3],是癌癥死亡的主要原因之一[4]。近期有報道顯示,每年預(yù)計(jì)有220萬例新發(fā)肺癌病例和180萬例新發(fā)死亡病例[5]。肺腺癌作為肺癌的主要組織學(xué)類型,約占肺癌病例的50%[6]。隨著技術(shù)的發(fā)展和新治療手段的開發(fā),肺腺癌的早期診斷領(lǐng)域已取得了一定的進(jìn)展,但肺腺癌患者的5年生存率仍然很低,復(fù)發(fā)率仍較高[7],因此,闡明肺腺癌發(fā)展涉及的分子機(jī)制,確定肺腺癌的新型預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),對于肺腺癌的治療具有重要的臨床價值[8-9]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類短(18～24個核苷酸)的單鏈非編碼RNA[10],主要通過結(jié)合mRNA的3′末端非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3-UTR)來沉默mRNA表達(dá)或降解靶mRNA,從而起到調(diào)控作用[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌細(xì)胞中,miR-1894-3p可以直接靶向mRNA Trim46的3′-UTR,下調(diào)Trim46的表達(dá),進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。已有多項(xiàng)研究表明,肺腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展受到miRNA的直接調(diào)控,如miRNA-126可增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力[13],miRNA-217上調(diào)可抑制FOXP1的表達(dá),進(jìn)而抑制肺腺癌的進(jìn)展[14]。miRNA-454-3p受到lncRNA HOXA11-AS的調(diào)控,影響肺腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性[15]。然而miRNA-144-3p在肺腺癌中的研究卻較少,其影響肺腺癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

細(xì)胞周期蛋白E2(Cyclin E2,CCNE2)是細(xì)胞周期蛋白(cyclin)家族的成員之一,能夠通過激活其細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)來驅(qū)動腫瘤細(xì)胞增殖[16]。CCNE2 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化,并在DNA復(fù)制、基因組穩(wěn)定性控制等方面發(fā)揮功能[17]?，F(xiàn)已有多篇文獻(xiàn)報道,CCNE2在肝癌[16]、乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、胰腺癌[20]等腫瘤中異常表達(dá)。如CCNE2在胃癌中顯著高表達(dá),能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程[21]。在肝細(xì)胞癌中CCNE2 的過表達(dá)會促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[22]。但是CCNE2在肺腺癌中的分子機(jī)制研究還較少。

本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌細(xì)胞為體外研究對象,研究miRNA-144-3p和CCNE2對肺腺癌細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制,旨在為肺腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和樣本來源 人肺腺癌細(xì)胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5均購自北納菌種保藏中心(BeNa Culture Collection,BNCC),貨號分別為BNCC338514、BNCC100120、BNCC338287、BNCC338054。從濮陽市人民醫(yī)院收集心胸外科手術(shù)切除的新鮮肺腺癌組織標(biāo)本和配對癌旁組織(距癌組織3～5 cm)標(biāo)本各20例。

1.2 主要試劑與儀器 10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗青/鏈霉素購自美國Gibco公司(貨號：10099、51985034、15140122);Lipofectamine?2000試劑、Trizol試劑、cDNA合成試劑盒購自美國賽默飛公司(貨號：11668019、A33250、11752025);miScript SYBR Green PCR 試劑盒購自德國Qiagen公司(貨號：331223);CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司(貨號：CK04);雙熒光素報告載體構(gòu)建自中國genePharma,雙熒光素報告檢測系統(tǒng)購自美國Promega 公司(貨號：N1610);100%乙醇購自嘉鼎化學(xué)(貨號：MFCD00003568);碘化丙啶、TBST、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RNA酶、封閉液、ECL試劑盒均購自碧云天生物公司(貨號：ST511、ST673、P0010、ST040、P0252、P0018S);兔單克隆抗體GAPDH、兔單克隆抗體CCNE2、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)均購自英國Abcam公司(貨號：ab181602、ab40890、ab205718)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司(型號：BB150);冷凍離心機(jī)購自美國賽默飛公司(型號：Heraeus Fresco 21);多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司(型號：ELX800UV);正置光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)、倒置熒光顯微鏡(MCT-001-150-S)購自日本Nikon公司;電泳儀購自韋克斯科技(北京)有限公司(型號：WIX-midiDNA)。7500實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司(型號：Prism?7500);6孔培養(yǎng)板、48孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板和Transwell 小室均購自美國 Corning 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞均用加入1%雙抗并且含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[23]。

1.3.2 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞生長至對數(shù)期時,將陰性對照模擬物(NC mimic)、微小RNA-144-3p模擬物(miRNA-144-3p mimic)以及周期蛋白E2的過表達(dá)質(zhì)粒載體(oe-CCNE2)和陰性對照(oe-NC)經(jīng)Lipofectamine?2000試劑瞬時轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞中,同樣將陰性對照抑制劑(NC inhibitor)、微小RNA-144-3p抑制劑(miRNA-144-3p inhibitor)以及周期蛋白的敲低質(zhì)粒載體(sh-CCNE2)和陰性對照(sh-NC)經(jīng)Lipofectamine?2000試劑瞬時轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞中,并在對應(yīng)的培養(yǎng)基5%CO2、37 ℃培養(yǎng),6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction) 用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。為了檢測miRNA-144-3p和CCNE2 的mRNA表達(dá),使用cDNA合成試劑盒將1 μg的miRNA-144-3p和CCNE2總RNA分別用于合成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR 試劑盒在以下熱循環(huán)條件下進(jìn)行定量PCR,miR-144-3p和CCNE2內(nèi)參物分別為U6和GAPDH,PCR條件：95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。2-ΔΔCt法用于測定相對基因表達(dá)。引物序列見表1。

1.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8,CCK-8)檢測細(xì)胞增殖 用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。將肺腺癌細(xì)胞系GLC-82的細(xì)胞(6×103個細(xì)胞/孔)接種在24孔板中。待細(xì)胞貼壁后,更換新鮮培養(yǎng)基100 μl,再加入CCK-8液10 μl,將細(xì)胞置于37 ℃孵育。在轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h檢測450 nm處的吸光度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.3.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 將GLC-82細(xì)胞以6×105個細(xì)胞/孔接種在24孔板中并孵育24 h。隨后,用0.8 μg pGL3-CCNE2-3′UTR WT和pGL3-CCNE2-3′UTR Mut質(zhì)粒,用0.08 μg phRL-SV40對照載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后使用Lipofectamine 2000試劑盒將miRNA-144-3p mimic及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后24 h,使用雙熒光素酶測定法檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)48 h,并在冰冷的70%乙醇中固定12 h。洗滌后,將細(xì)胞與0.25 mg/ml RNase在37 ℃孵育30 min。將細(xì)胞重懸于碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)溶液(50 μg/ml)中,并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.3.7 免疫印跡(Western blot,WB) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,將各組細(xì)胞使用冷PBS洗滌3次,加入全蛋白裂解液(RIPA)后冰上裂解10 min,離心,收集上清液,BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上清液與上樣緩沖液混勻后,95 ℃變性10 min,取60 μg總蛋白在100 V的恒壓下使用SDS-PAGE膠分離。電泳結(jié)束后,以100 mA、120 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜,封閉液(5% BSA/TBST)封閉60 min,加入一抗,4 ℃過夜孵育。其中一抗分別為：兔單克隆抗體GAPDH(1∶10 000),兔單克隆抗體CCNE2(1∶10 000)。一抗孵育完畢后,用1×TBST溶液室溫下?lián)u床搖動洗膜,洗3次,每次5 min,加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶20 000),室溫下孵育120 min,1×TBST洗膜3次,每次20 min后,用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),觀察蛋白印記,并進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表達(dá) 由癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,miRNA-144-3p在肺腺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)(圖1A)。臨床樣本檢測結(jié)果顯示,相比于癌旁組織,癌變組織的miRNA-144-3p表達(dá)水平顯著降低(圖1B)。采用實(shí)時熒光定量PCR分別檢測miRNA-144-3p在人肺腺癌細(xì)胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與肺成纖維細(xì)胞相比,miRNA-144-3p在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低(圖1C),此外,由于miRNA-144-3p在GLC-82細(xì)胞系中下調(diào)最明顯,因此選擇該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表達(dá)

2.2 過表達(dá)miRNA-144-3p抑制細(xì)胞增殖 向GLC-82細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-144-3p mimic,以檢測miRNA-144-3p對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-144-3p mimic的肺腺癌細(xì)胞相較于轉(zhuǎn)染NC mimic的細(xì)胞,其miRNA-144-3p表達(dá)量顯著增加(圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC mimic組相比,過表達(dá)miRNA-144-3p后,肺腺癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降(圖2B)。

圖2 過表達(dá)miRNA-144-3p抑制細(xì)胞增殖

2.3 驗(yàn)證miRNA-144-3p與CCNE2的靶向性 miRNAs通常會與下游mRNAs發(fā)生作用,表現(xiàn)出抑制功能。因此,應(yīng)用starBase、miRDB、miRWalk數(shù)據(jù)庫對miRNA-144-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測,并與TCGA數(shù)據(jù)庫中分析得到的表達(dá)上調(diào)基因取交集,結(jié)果顯示,miRNA-144-3p下游存在靶基因CCNE2,同時用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CCNE2的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)(圖3A)。臨床樣本檢測結(jié)果顯示,相比于癌旁組織,癌變組織CCNE2的表達(dá)水平顯著升高(圖3B)。本研究選擇相應(yīng)細(xì)胞系,采用qRT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)檢測CCNE2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常細(xì)胞系相比,CCNE2在肺腺癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)(圖3C)。通過靶基因預(yù)測軟件miRTarBase預(yù)測miRNA-144-3p與CCNE2的靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖3D),采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證CCNE2和miRNA-144-3p之間的靶向關(guān)系,結(jié)果見圖3E,在CCNE2野生型組中miRNA-144-3p mimic處理顯著降低了熒光素酶報告基因活性,而在CCNE2突變型組中miRNA-144-3p的過表達(dá)對熒光素酶活性無顯著影響,表明CCNE2和miRNA-144-3p可以特異性結(jié)合。qRT-PCR和Western blot結(jié)果(圖3F)顯示,肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-144-3p mimic后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組,而轉(zhuǎn)染了miRNA-144-3p inhibitor后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組。綜上,miRNA-144-3p能靶向下調(diào)CCNE2。

圖3 驗(yàn)證miR-144-3p與CCNE2的靶向性

2.4 miRNA-144-3p靶向下調(diào)CCNE2,抑制細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期 為了研究miR-144-3p與CCNE2在肺腺癌中的調(diào)控作用,本研究構(gòu)建了不同的表達(dá)處理組,采用qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果見圖4A。圖4A結(jié)果顯示,過表達(dá)CCNE2后,CCNE2表達(dá)水平顯著升高,進(jìn)一步過表達(dá)miRNA-144-3p后,CCNE2表達(dá)水平顯著降低,恢復(fù)至oe-NC+NC mimic組水平。此外,采用CCK-8檢測不同處理組細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示,肺腺癌細(xì)胞在單獨(dú)過表達(dá)CCNE2后,其細(xì)胞增殖能力顯著提高。當(dāng)共轉(zhuǎn)染oe-CCNE2和miRNA-144-3p mimic時,相對于只轉(zhuǎn)染oe-CCNE2組,細(xì)胞增殖能力顯著降低,但依舊高于oe-NC+NC mimic組(圖4B)。各組細(xì)胞的細(xì)胞周期見圖4C,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染oe-CCNE2的細(xì)胞和對照組相比,S期細(xì)胞占比顯著增加,G1期細(xì)胞占比減少,細(xì)胞周期進(jìn)程加快。共轉(zhuǎn)染miRNA-144-3p mimic和oe-CCNE2的細(xì)胞相較于只轉(zhuǎn)染oe-CCNE2的細(xì)胞,S期細(xì)胞占比顯著減少,G1期細(xì)胞占比增加。另外,本研究驗(yàn)證了敲低miRNA-144-3p對CCNE2的調(diào)控作用。結(jié)果如圖4D-F所示,敲低CCNE2后,細(xì)胞增殖能力顯著降低,G1期細(xì)胞顯著增加,S期細(xì)胞顯著減少,進(jìn)一步加以miRNA-144-3p inhibitor處理后,GLC-82細(xì)胞中CCNE2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期水平恢復(fù)至sh-NC+NC inhibitor組水平。結(jié)果表明,miRNA-144-3p可靶向CCNE2調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。

圖4 miRNA-144-3p靶向下調(diào)CCNE2,抑制細(xì)胞增殖并阻滯細(xì)胞周期

3 討論

盡管近幾十年來肺癌的診斷和治療技術(shù)取得了重大進(jìn)展,但治療效果仍不盡人意,患者預(yù)后效果不理想[24]。因此,迫切需要開發(fā)針對肺腺癌惡性進(jìn)展有效且安全的療法。國內(nèi)研究表明,miRNA在調(diào)節(jié)肺腺癌發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,例如miRNA-148b-3p與肺腺癌的腫瘤等級和腫瘤大小顯著相關(guān),是肺腺癌患者整體生存的獨(dú)立預(yù)測標(biāo)志物[25];miRNA-375在肺腺癌中顯著上調(diào),其調(diào)控作用對肺腺癌的進(jìn)展至關(guān)重要[26];miRNA-145靶向N-cadherin 抑制肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力等[27]。因此,本研究探究了在肺腺癌中異常表達(dá)的miRNA-144-3p對癌細(xì)胞表型的影響及其下游相關(guān)的分子機(jī)制。

miRNA-144-3p在癌癥研究中已被廣泛報道,其參與了肝癌、鼻咽癌、甲狀腺腫瘤、腎透明細(xì)胞癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[28-32]。如miRNA-144-3p的異位表達(dá)顯著阻斷了肺鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[33]。miRNA-144靶向PURA,抑制了食道癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力[34]。miRNA-144-3p對EGFR的負(fù)調(diào)控可對骨肉瘤的生長和遷移起到負(fù)面影響[35]。由此,miRNA-144-3p在腫瘤中的調(diào)控作用是普遍存在的。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn),確定miRNA-144-3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá),CCK8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miRNA-144-3p能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖。

有研究表明,miRNA-144-3p可通過靶向不同的基因,如RP105[36]、YAP[37],從而起到調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因而,為了探究miRNA-144-3p影響肺腺癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制,我們利用targetscan網(wǎng)站,挖掘得到與miRNA-144-3p有靶向結(jié)合關(guān)系的下游基因CCNE2。此外,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證明了兩者的靶向結(jié)合關(guān)系。CCNE2是細(xì)胞周期家族的成員之一,通過激活其激酶伴侶細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2來驅(qū)動細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化[17],以促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]。在卵巢癌中CCNE2顯著上調(diào),并與患者的預(yù)后不良相關(guān)[38]。在非小細(xì)胞肺癌中CCNE2受miRNA-3607-3p的靶向調(diào)控,影響癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在本研究中,我們通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-144-3p 能夠逆轉(zhuǎn)CCNE2對肺腺癌細(xì)胞增殖能力和周期分布的影響。

綜上,本研究表明,在肺腺癌細(xì)胞中miRNA-144-3p表達(dá)顯著下調(diào),而CCNE2表達(dá)顯著上調(diào)。并且miRNA-144-3p能夠通過靶向CCNE2發(fā)揮抑制肺腺癌細(xì)胞增殖,并將細(xì)胞周期阻滯于G1期的作用,表明miRNA-144-3p可能是肺腺癌治療的潛在分子靶標(biāo)。但是本研究有不足之處,如主要以肺腺癌細(xì)胞株為研究對象,通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該分子機(jī)制,后續(xù)還有待利用動物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和完善,未來還需納入臨床樣本進(jìn)行檢測和前瞻性分析,使其真正能應(yīng)用于臨床。