姚宗澤，楊艷，王世敏，劉艷芳

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2.昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000）

【研究意義】玉米（Zea maysL.）是世界上最重要的糧食作物之一，我國玉米常年種植面積和總產(chǎn)量均排在糧食作物的第一位。玉米雜交種具有高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)等特征，深受人們喜愛，在國家糧食安全中發(fā)揮著重要作用［1］。在云南，玉米有著悠久的栽培歷史［2］，也正是由于玉米能適應(yīng)云南多樣性的地理環(huán)境和各種氣候類型，滿足當(dāng)?shù)厣a(chǎn)［3］，云南成為我國重要的玉米生產(chǎn)區(qū)。近年來，云南玉米播種面積和產(chǎn)量均占全國前十位。在玉米生產(chǎn)過程中，種子是獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵基礎(chǔ)［4］，也是假冒套牌、侵權(quán)糾紛的主要根源［5］。為保護(hù)育種創(chuàng)新，我國于2000年實(shí)施植物新品種保護(hù)制度，玉米列入我國第一批植物新品種保護(hù)名錄。2022 年3 月1 日，新修訂的《種子法》［6］將植物品種權(quán)保護(hù)環(huán)節(jié)由原來的“生產(chǎn)、繁殖、銷售”擴(kuò)大為“生產(chǎn)、繁殖和為繁殖而進(jìn)行處理、許諾銷售、銷售、進(jìn)口、出口以及為實(shí)施上述行為儲存該授權(quán)品種的繁殖材料”，將保護(hù)范圍由原來的“繁殖材料”延伸至“繁殖材料和收獲材料”，將賠償數(shù)額上限、限額由原來的“三倍、300 萬”增加到“五倍、500萬”。通過保護(hù)環(huán)節(jié)、保護(hù)范圍和賠償金額三方面進(jìn)一步加大對植物新品種權(quán)的保護(hù)。更為重要的是，新《種子法》建立了實(shí)質(zhì)性派生品種制度，即確定為實(shí)質(zhì)性派生的品種在后期生產(chǎn)銷售過程中，需向其原始品種支付費(fèi)用。根據(jù)我國植物新品種保護(hù)制度，申請品種權(quán)的玉米品種須進(jìn)行DUS 測試［7］。DUS 測試采用測試指南中列出的性狀對申請品種和近似品種進(jìn)行測定，綜合申請品種和近似品種在各性狀上表達(dá)狀態(tài)，得出申請品種是否具備特異性，即是否新品種的結(jié)論［8］。DUS 測試性狀通常是表型性狀，包含質(zhì)量性狀、假質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀。鑒于數(shù)量性狀通常由多基因控制，呈現(xiàn)一維、連續(xù)的表達(dá)狀態(tài)，且容易受環(huán)境影響，一般認(rèn)為當(dāng)申請品種和近似品種在兩個以上數(shù)量性狀上有區(qū)別且僅在數(shù)量性狀上有區(qū)別時，可判定申請品種具備特異性［9］。因此，不同于常規(guī)表型性狀，DUS 測試性狀在品種區(qū)分判定上具有特殊要求，隨著實(shí)質(zhì)性派生品種制度的建立，該要求愈發(fā)突出?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外開展了大量玉米表型性狀的研究，在水稻［10］、大豆［11］、黃瓜［12］、辣椒等［13-14］作物多樣性研究上也有大量報道。譚禾平等［15］以國內(nèi)18 個省市收集的115 個糯玉米品種為研究材料，測試了9 個農(nóng)藝性狀，對其進(jìn)行相關(guān)分析和多樣性分析，結(jié)果表明，有10 對農(nóng)藝性狀間存在極顯著相關(guān)關(guān)系，6對存在顯著相關(guān)關(guān)系。陳海榮等［16］利用DUS 測試指南中的36 個性狀對53 份玉米標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行形態(tài)性狀多樣性分析，結(jié)果檢測到193個等位變異，平均每個性狀檢測到5.3611 個，有效等位變異平均為3.5756 個，平均Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)為1.3094。盧柏山等［17］利用DUS 測試中的47 個性狀對15 份普通玉米自交系和13 份糯玉米骨干自交系進(jìn)行研究，47 個性狀的Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)存在較大差異。劉玄等［18］以5 個玉米雜交組合在7 個試點(diǎn)的11 個性狀為研究對象，對各個性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計、相關(guān)性分析以及頻率分析，得出生育期與單穗粒重達(dá)到顯著負(fù)相關(guān)水平，株高與穗位高達(dá)到極顯著正相關(guān)水平，穗長與穗粗和單穗粒重均達(dá)極顯著正相關(guān)，與禿尖達(dá)顯著正相關(guān)，穗行數(shù)與百粒重達(dá)顯著負(fù)相關(guān)，產(chǎn)量與株高和穗位高呈顯著正相關(guān)結(jié)論。馮素芬等［19］對云南省2016—2020 年審定的18 個鮮食玉米品種進(jìn)行生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)性狀和抗病性等分析，認(rèn)為參試品種的性狀表現(xiàn)存在一定差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已報道的相關(guān)研究大多圍繞產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的表型性狀，圍繞DUS 測試性狀的研究主要使用測試指南標(biāo)準(zhǔn)品種［16］、自交系［17］和鮮食玉米［15,19］等材料，以雜交種為材料，圍繞DUS 測試性狀開展的研究較少，特別是DUS 測試性狀在高原低緯地區(qū)玉米雜交種上應(yīng)用的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以2020—2021 年進(jìn)行玉米DUS 測試的云南育成的雜交種為材料，對38 個DUS 測試性狀進(jìn)行多樣性分析和相關(guān)性分析。為評價當(dāng)前DUS 測試性狀在雜交種區(qū)分鑒定上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為實(shí)質(zhì)性派生品種制度在玉米DUS 測試上的落地實(shí)施提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020 年和2021 年在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種DUS 測試（昆明）分中心完成測試的89 個玉米雜交種，均為云南地區(qū)育成的單交種，以編號V01～V89 代替品種名稱，適宜在云南、貴州等西南高原低緯玉米種植區(qū)中海拔區(qū)域種植。根據(jù)種植區(qū)的具體海拔和氣候條件，可春播或夏播，對栽培條件和管理措施無特殊要求。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間設(shè)計 2020 年4 月至2021 年11 月，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種DUS 測試（昆明）分中心測試基地進(jìn)行兩個周期的田間測試。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，單行種植，株距0.3 m，行距0.6 m，行長3.0 m，每個小區(qū)種4 行，種植密度為55 583株/hm2，設(shè)兩個重復(fù)，田間管理與大田種植管理一致。

1.2.2 性狀調(diào)查 性狀調(diào)查方法、時期及每個性狀表達(dá)狀態(tài)的賦值方法嚴(yán)格按照玉米DUS 測試指南（GB/T 19557.24-2018）［20］要求進(jìn)行，測試性狀共38 個（表1），其中目測性狀26 個（Tra.1～Tra.26），測量性狀12 個（Tra.27～Tra.38）。

表1 38 個測試性狀名稱及編號Table 1 Names and numbers of 38 testing traits

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 多樣性分析 以Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)為指標(biāo)，采用PopGen32 軟件分析性狀多樣性［21］。Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)計算公式為：

式中，I為多樣性指數(shù)，Pij為某個性狀某個代碼出現(xiàn)的概率，i為性狀編號，j為性狀表達(dá)水平代碼。

1.3.2 相關(guān)性分析 利用SPSS19.0 軟件，分別計算26 個目測性狀和12 個測量性狀之間的相關(guān)系數(shù)，分析其相關(guān)性。

1.3.3 品種聚類分析 利用NTSYSpc 2.10e 軟件中的SM 法計算遺傳相似系數(shù)，采用SAHN Clustering 和非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，繪制玉米品種遺傳聚類系統(tǒng)樹［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米雜交種測試性狀多樣性分析

由表2 可知，38 個性狀在89 個玉米雜交種中檢測到191 個表達(dá)狀態(tài)，平均每個性狀檢測到5.0263 個，變幅為2～8 個；平均有效表達(dá)狀態(tài)為2.8217 個，變幅為1.0227～6.0697 個；38 個性狀平均Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)為1.0669，變幅為0.0616～1.9069，可見不同性狀的多樣性表現(xiàn)差異較大。其中，葉片綠色程度（Tra.3）、葉片邊緣花青甙顯色（Tra.8）、莖稈“之”字形程度（Tra.17）、果穗形狀（Tra.21）4 個性狀在89 個玉米品種中均只出現(xiàn)2 種表達(dá)狀態(tài)，有效表達(dá)狀態(tài)數(shù)和Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)較低；雄穗花藥花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.10）、雄穗穎尖花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.13）、雄穗側(cè)枝彎曲程度（Tra.16）、莖稈支持根花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.18）在89 個玉米品種中均出現(xiàn)8 個表達(dá)狀態(tài)，有效表達(dá)狀態(tài)數(shù)和Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)較高。

表2 89 個玉米雜交種38 個測試性狀的多樣性分析Table 2 Diversity analysis of 38 testing traits in 89 maize hybrids

2.2 玉米雜交種測試性狀相關(guān)性分析

由表3 可知，26 個目測性狀中，多對性狀間存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系。其中，散粉期（Tra.4）與抽絲期（Tra.5）、雄穗穎片基部花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.12）與雄穗穎片中部花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.14）、雄穗穎尖花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.13）與雄穗穎片中部花青甙顯色強(qiáng)度（Tra.14）、雄穗側(cè)枝與主軸夾角（Tra.15）與雄穗側(cè)枝彎曲程度（Tra.16）、籽粒頂端主要顏色（Tra.23）與籽粒背面主要顏色（Tra.24）這5 對性狀之間存在極顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均較高，分別為0.94、0.57、0.62、0.53、0.78。

由表4 可知，12 個測量性狀中，雄穗最低位側(cè)枝以上主軸長度（Tra.27）與雄穗最高位側(cè)枝以上主軸長度（Tra.28）、雄穗最低位側(cè)枝以上主軸長度（Tra.27）與雄穗側(cè)枝長度（Tra.30）、雄穗最高位側(cè)枝以上主軸長度（Tra.28）與雄穗側(cè)枝長度（Tra.30）、雄穗最高位側(cè)枝以上主軸長度（Tra.28）與葉片長度（Tra.31）、植株穗位高度（Tra.33）與植株高度（Tra.34）、植株穗位高度（Tra.33）與穗位高/ 株高比率（Tra.35）、果穗直徑（Tra.37）與果穗穗行數(shù)（Tra.38）這7對性狀之間存在極顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均較高，分別為0.84、0.73、0.51、0.50、0.67、0.90、0.55。

表4 89 個玉米雜交種12 個測量性狀間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of 12 measured traits in 89 maize hybrids

2.3 玉米雜交種聚類分析

由圖1 可知，品種間相似系數(shù)為0.24～0.53。其中，在相似系數(shù)0.296 位置，可以將89 個玉米品種劃分為5大類群，分別包括1、1、2、81、4個品種，分別占調(diào)查品種1.1%、1.1%、2.2%、91.1%、4.5%，以第Ⅳ類群品種數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他類群。

圖1 89 個玉米雜交種的形態(tài)性狀聚類結(jié)果Fig.1 Clustering results of morphological traits in 89 maize hybrids

3 討論

3.1 品種間的性狀多樣性分析

與陳海榮等［16］利用DUS 測試指南36 個測試性狀對53 份玉米標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行性狀多樣性分析的結(jié)果相比，本研究基于89 個玉米雜交種的38個測試性狀多樣性相關(guān)指數(shù)略微低于標(biāo)準(zhǔn)品種的參數(shù)，89 個品種間的相似系數(shù)為0.24～0.53，最大相似系數(shù)較陳海榮等［16］和盧柏山等［17］的研究結(jié)果要低，不僅表明本研究使用的89 個雜交種多樣性較好，品種間的差異大，還表明玉米DUS 測試指南性狀在雜交種中多態(tài)性高，區(qū)分力強(qiáng)。本研究中，聚類劃分的5 大類群中，第Ⅳ類群包含了81 個品種，表明第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ 4 個類群間及其與第Ⅳ類群間存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，這4 個類群品種差異明顯；第Ⅳ類群雖然包含81 個品種，但在該類群中最相近的兩個品種間的相似系數(shù)也非常低（0.53），進(jìn)一步表明89 個品種多樣性較好，品種間差異大。徐曉美等［23］對96 份辣椒種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析時發(fā)現(xiàn)辣椒來源豐富，但存在同質(zhì)材料，建議在種質(zhì)保存時可以適當(dāng)舍棄部分同質(zhì)材料。從本研究結(jié)果來看，該89 個玉米品種間遺傳差異大，同質(zhì)化不突出。

3.2 測試性狀間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，本研究38 個測試性狀中有12 對性狀間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明這12 對性狀在遺傳上存在不同程度連鎖關(guān)系。目測性狀中有5 對性狀間呈極顯著正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)較高，分別為0.94、0.57、0.62、0.53、0.78，與姚宗澤等［24］之前的研究結(jié)果一致；測量性狀中有7 對性狀間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.84、0.73、0.51、0.50、0.67、0.90、0.55，這與前人研究結(jié)果也相吻合［16-17］。其中，散粉期（Tra.4）與抽絲期（Tra.5）、植株穗位高度（Tra.33）與穗位高/株高比率（Tra.35）間的相關(guān)系數(shù)分別為0.94、0.90，均高于之前許多研究結(jié)果［16,18,24］。

3.3 相關(guān)性顯著的性狀在特異性及實(shí)質(zhì)性判定中的應(yīng)用

品種DUS 測試特異性判定時，如果測試品種和近似品種間的差異僅體現(xiàn)在數(shù)量性狀上，通常要求品種間至少在兩個以上數(shù)量性狀上具有差異才判定為品種具備特異性［9］。因此，特異性判定時需充分考慮上述數(shù)量性狀相關(guān)性。根據(jù)性狀間的相關(guān)性分析，當(dāng)兩個性狀間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系時，特異性判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)上調(diào)，這樣可以使特異性判定結(jié)果更加客觀、科學(xué)。此外，2022 年新修訂《種子法》建立了實(shí)質(zhì)性派生品種制度［7］。實(shí)質(zhì)性派生品種和原始品種除派生過程產(chǎn)生的差異外，受原始品種的基因型或基因型組合控制的基本性狀表達(dá)與原始品種相同。可見，性狀間相關(guān)性也是判定實(shí)質(zhì)性派生品種及其原始品種的重要考慮因素。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，38 個DUS 測試性狀在玉米雜交種中的表達(dá)狀態(tài)豐富、多態(tài)性好，89 個雜交玉米品種間的相似系數(shù)較低，品種多樣性較好，品種間差異大，同質(zhì)化程度不突出。本研究的38個測試性狀中有12 對性狀間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明這12 對性狀在遺傳上存在不同程度連鎖關(guān)系，后期研究可以進(jìn)一步深入挖掘和探索它們之間的連鎖效應(yīng)。在當(dāng)前的品種DUS 測試特異性判定和未來落實(shí)實(shí)質(zhì)性派生品種制度上，厘清測試性狀間的相關(guān)性程度尤其重要。當(dāng)兩個性狀間存在極顯著正相關(guān)時，特異性判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)上調(diào)，權(quán)重適當(dāng)降低，這樣可以使特異性判定結(jié)果更加客觀、科學(xué)。同時，也為實(shí)質(zhì)性派生品種判定標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定提供前期數(shù)據(jù)。