陳 勇，李汶鍾，彭林潤 ，王明懷

(1.重慶市大足區(qū)西山林場，重慶 402360； 2.廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520)

銀木(Cinnamomumseptentrionale)，又名大葉樟和土沉香等，屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，學名大葉香樟，是中國南方珍貴用材和特用經(jīng)濟樹種，為亞熱帶常綠闊葉林的代表樹種。銀木是常綠大喬木，在8～10年生時生長最快，樹高可達50 m，胸徑可達5 m；木材具芳香且易加工，可制樟木箱及作建筑用材；根材美麗可用作美術品；枝、根、葉均可提制樟油，具有多種用途，種子可榨油，葉還可制作紙漿粘合劑；它喜溫暖濕潤氣候、喜光、稍耐陰、深根性、萌芽性強；它還具有凈化和美化環(huán)境的功效[1]。作為重要的經(jīng)濟樹種之一，銀木具有生長快、材質好、適應范圍廣、抗病蟲害能力強、造林成活率高和用途廣等諸多優(yōu)點，自古以來深受廣大人民群眾喜愛，被廣泛用作庭蔭樹、行道樹、防護林及風景林[2-3]。

從國內(nèi)已發(fā)表的文獻上看，關于銀木的相關研究不多，主要集中在引種栽培[4-7]、繁殖技術[8-14]、成分分析[15-19]和生理生態(tài)[20-24]等方面。有關遺傳等方面的基礎研究極少，柯艷妮等[25]利用RAPD標記技術首次分析了銀木和樟樹(Cinnamomumcaphora)的遺傳多樣性與親緣關系；劉玉香[26]采用ISSR標記分析了樟科主要樹種的親緣關系；目前已開展核型研究的樟科植物有42種，除無根藤(Cassythafiliformis)、月桂(Laurusnobilis)和美國檫木(Sassafrastzumu)為3倍體、臺灣新木姜子(Neolitseasericea)為6倍體以外，其余包括銀木在內(nèi)的38種植物的染色體數(shù)均為24(2n=2X=24)[26]。

林木種子園是林木種質資源利用最重要的方式之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，大約有50多個國家建立了90多個樹種的林木種子園。我國林木種子園的營建開始于20世紀60年代，目前絕大多數(shù)樹種已完成了第1代的改良工作，正在向高世代改良發(fā)展，馬尾松(Pinusmassoniana)、油松(Pinustabuliformis)已開始了第2代種子園的建設，杉木已開始第4代種子園的建設[27-28]。銀木是重慶市優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種之一，重慶市大足區(qū)有著悠久的銀木栽培歷史，有得天獨厚的自然環(huán)境條件，非常適合其生長。重慶市大足區(qū)西山林場早在上個世紀80年代就開始建立了銀木母樹林，于1992年通過重慶市林業(yè)局組織驗收，2011年經(jīng)重慶市林業(yè)局審定為林木良種。目前在建的我國第一個銀木實生種子園于2012年2月被批準為國家級林木良種基地。

目前，國內(nèi)有關銀木種子園的基礎研究是空白的，同時銀木的基因組尚未測序。本項研究以銀木同屬物種沉水樟(Cinnamomummicranthum)的基因組作為參考基因組，采用Illumina HiSeq PE150測序策略開發(fā)銀木SNP分子標記，對種子園內(nèi)來自重慶大足區(qū)、銅梁區(qū)、宜賓市、高縣、江安縣、宜賓縣、興文縣的59株銀木優(yōu)樹構建親緣關系圖譜，并估算群體雜合度和核苷酸多樣性，為今后銀木種子園的改良和良種選育提供基礎數(shù)據(jù)和信息。

1 試驗地概況

本項研究試驗地在西山林場，位于重慶市大足區(qū)東南邊陲，坐落于巴岳山脈分水嶺西側，東鄰銅梁，北與潼南接壤，南與永川、榮昌毗鄰，西連四川安岳，地理位置105°46′—105°57′E，29°25′—29°39′N。該區(qū)域屬亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，熱量豐富，雨量充沛，四季分明，空氣濕度大，日照偏少，無霜期長，春季冷空氣頻繁，盛夏伏旱較多，初夏和秋季多綿雨，冬季霜雪較少。

2 材料與方法

2.1 銀木種子園建園親本材料

2014—2016年，西山林場項目組在大足區(qū)等地共選擇了銀木優(yōu)樹59株進行采種(見表1)，主要采集地為重慶市大足區(qū)(DZ)、銅梁區(qū)(TL)、宜賓市(YBS)、高縣(GS)、江安縣(JA)、宜賓縣(YB)和興文縣(XW)，其中29株來自大足區(qū)。

2017年春，將采集的優(yōu)樹種子用于育苗。而后選擇了2 622株優(yōu)樹半同胞子代苗作為材料，在重慶市大足區(qū)西山林場建立了20 hm2的銀木實生種子園。該種子園少數(shù)單株于2021年始花，后逐步進入開花結實時期。從2022年開花結實的2個單株來看，結實面大，果實多，座果率也比較高。

2.2 試驗設計與方法

2.2.1 銀木SNP標記開發(fā)

因銀木尚未開展全基因組測序，本項目采用GBS簡化基因組測序策略，用酶切的方法獲得Tags再進行測序。首先，采集銀木種子園內(nèi)全部親本的新鮮幼嫩葉片，采用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取全部樣本的DNA，匯總檢測合格的DNA樣品后制備文庫，然后在Illumina HiSeq/Mi Seq平臺進行測序。參考基因組采用的是已經(jīng)完全測序的銀木同屬物種沉水香基因組。參考基因組總長度為730 416 403 bp，GC含量為38.34%，Gap率為0.31%，N50長度為50 350 591 bp，N90長度為37 069 385 bp。

2.2.2 SNP檢測、親緣關系與遺傳多樣性分析

采用SAMTOOLS等軟件對銀木全部樣本進行群體SNP的檢測。根據(jù)銀木群體內(nèi)個體的SNPs，計算個體之間的距離，然后采用neighbor-joining方法構建進化樹。

根據(jù) Nei[29]提供的經(jīng)典公式計算期望群體雜合度(He)。計算公式如下：

(1)

式中：m為基因座位數(shù)；n為每個基因座位的等位基因數(shù)；pij為第i基因座位第j等位基因的頻率。He值的范圍從 0(說明無多態(tài)性)到 1(說明無限多個等位形式具有相同的頻率，是個極限值)。

觀測雜合度(Ho)是隨機抽取的兩個樣本的等位基因不相同的概率。計算公式如下：

觀測雜合度 (Ho)=觀察得到雜和個體數(shù)/樣本個體數(shù)總數(shù)

(2)

在一個隨機交配群體中，π是核苷酸水平上的雜合度。根據(jù)兩個序列間每個位點上核苷酸差異的平均值來計算核苷酸水平上的雜合度(π)。計算公式如下：

(3)

式中：q是等位基因的總數(shù)，xi是第i個等位基因的群體頻率，dij是第i個和第j個等位基因間每個座位的核苷酸差異數(shù)或替代數(shù)。

3 結果與分析

3.1 銀木與同屬物種沉水樟的參考基因組比對結果

59個銀木樣本與沉水樟的基因組比對結果詳見表2。從表2中可知，銀木與沉水樟基因組比對率非常高，最低比對率為94.21%，最高比對率為96.60%，平均值為96.13%。

表2 銀木59個樣本與參考基因組的比對結果Tab.2 Comparative statistics of 59 samples of Cinnamomum camphora and reference genome 樣本比對片段總片段比對率/%樣本比對片段總片段比對率/%12 401 2802 303 54195.9322 773 5722 670 81896.3033 333 0423 216 13396.4943 419 2063 293 00796.3153 157 8023 037 83396.2062 852 8262 738 05795.9873 470 4963 347 64196.4683 354 6343 232 30996.3593 302 5623 176 93596.20103 036 2182 921 72296.23113 821 6063 675 97296.19123 306 6883 186 19196.36133 011 6962 890 85195.99144 370 1304 194 08795.97152 886 6562 741 59494.97163 036 1202 907 80895.77174 229 7144 049 40795.74183 048 4322 927 80596.04193 461 5403 329 30696.18203 856 9003 704 89996.06213 122 3083 003 49996.19223 337 6883 214 02296.29235 128 5004 944 66696.42242 944 3362 835 39996.30252 736 3122 627 98396.04262 560 5962 462 89996.18272 747 8682 649 35296.41282 535 5482 444 52296.41292 630 1322 534 40496.36302 605 2082 506 77896.22312 987 7722 870 78596.08322 407 0342 311 30096.02332 220 5422 131 56095.99342 985 3822 875 84096.33353 006 1722 900 42196.48362 552 1282 460 74696.42372 575 1462 481 42996.36382 818 5282 710 29396.16392 989 4142 887 81296.60402 979 2262 865 01996.17412 653 0862 545 83995.96422 931 0402 809 52395.85432 829 3302 727 70796.41442 955 2022 816 08795.29452 939 2102 825 55496.13462 851 1722 747 48996.36473 141 0203 030 39496.48482 711 0582 602 81696.01492 475 3842 379 47396.13502 539 5982 446 19196.32512 705 0682 548 51694.21521 957 1121 881 50796.14532 869 0062 761 75496.26542 919 9222 808 97696.20552 813 4102 712 90696.43562 380 1122 290 27196.23573 067 7282 946 78596.06582 339 5222 250 29596.19592 355 7362 260 06895.94

3.2 銀木SNP位點

59個銀木樣本共獲得了 2367053 個SNP 位點，經(jīng)過條件為 dp1(保留樣本深度不低于1x的數(shù)據(jù))、Miss 0.2(保留樣本缺失率不高于0.2的數(shù)據(jù))、maf 0.05 (保留樣本最小等位基因頻率不小于0.05的數(shù)據(jù))進行過濾，過濾后共獲得了 127825 個SNP 位點，過濾后位點用于后續(xù)親緣關系和遺傳多樣性分析。

3.3 銀木59個優(yōu)樹個體間親緣關系及群體遺傳多樣性分析

59個樣本按照采樣點分為7個群體進行親緣關系分析(見圖1)。依據(jù)127 825個SNP位點信息，可以大致分成如下四大類：第一大類包括來自大足區(qū)的3、13、16、23、33和35號親本，來自高縣的46和49號親本，來自宜賓縣的58號親本和來自銅梁區(qū)的26、27和31號親本；第二大類僅為來自大足區(qū)的4號親本；第三大類包括來自大足區(qū)的24和25號親本，來自高縣的50號親本以及來自銅梁區(qū)的28和29號親本；第四大類包括來自大足區(qū)的1、2、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、19、20、21、22、32、34號親本，來自宜賓市的36、37、38、39、40、41、42號親本，來自宜賓縣的55、56、57號親本，來自高縣的43、44、45、47、48和51號親本，來自銅梁區(qū)的30號親本，來自江安縣的52、53和54號親本以及來自興文縣的59號親本。

圖1 銀木59個優(yōu)樹親本的親緣關系圖Fig.1 Genetic relationship of 59 superior tree parents of Cinnamomum septentrionale 注：DZ為大足區(qū)；TL為銅梁區(qū)；YBS為宜賓市；GX為高縣；JA為江安縣；YB為宜賓縣；XW為興文縣。

銀木種子園中的59個優(yōu)樹親本群體遺傳多樣性分析結果為：期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)分別為0.1696和0.1916，核苷酸多樣性(pi)的值為0.1712，表明群體的遺傳多樣性屬于中等偏下。

4 結論與討論

重慶市大足區(qū)西山林場2019年建立的20 hm2銀木實生種子園目前已進入開花結實階段。通過以銀木同屬物種沉水樟的基因組作為參考基因組和GBS測序策略共開發(fā)了127825個銀木SNP分子標記。銀木與沉水樟基因組比對分析結果顯示，平均比對率為96.13%。銀木種子園中的59個優(yōu)樹親本群體期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)分別為0.1696和0.1916，核苷酸多樣性(pi)為0.1712，揭示出目前的銀木種子園親本群體的遺傳多樣性屬于中等偏下。

林木種子園的親本群體遺傳多樣性水平不僅直接關系到種子園本身，而且對高世代改良和育種將產(chǎn)生較大影響[27]。通過對重慶市大足區(qū)西山林場銀木種子園的親本進行SNP標記分析，我們發(fā)現(xiàn)目前建園的親本群體遺傳多樣性偏低，主要原因是這些群體的區(qū)域相對集中。從構建的銀木59個優(yōu)樹親本的親緣關系圖中(見圖1)我們不難看出來自相同地點的部分優(yōu)樹個體親緣關系非常近，如來自大足區(qū)的8和9號、12和15號、19和22號、17和18號、32和34號、13和23號親本以及來自宜賓市的40和42號親本。一方面，我們在對初級實生種子園進行升級改造時，可以根據(jù)親本的生長和結實表現(xiàn)以及子代測定結果進行親本有效選擇，去除那些親緣關系非常近的表現(xiàn)不好的親本；另一方面，必須繼續(xù)加大我國銀木種質資源的收集，擴大目前的基因庫。

林木種子園主要有實生和嫁接種子園兩種類型。重慶市大足區(qū)西山林場的銀木種子園為實生種子園，這是由于在建園時尚未解決銀木的嫁接問題而不得已采用的方式。隨著銀木嫁接技術的突破和提高，對去劣的親本可以通過嫁接方法選擇優(yōu)株材料進行改造。這樣原有實生種子園可以逐步被改造成嫁接種子園從而提早開花結實或建成實生嫁接混合型種子園。

20世紀80年代以來，各種類型的DNA分子標記不斷被開發(fā)，AFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SSR、SRAP、SNP等分子標記已成功應用在林木遺傳改良理論研究和實踐中，如在品種鑒定、親緣關系、遺傳多樣性、分子連鎖圖譜構建、輔助育種等方面的研究中得到廣泛應用[30-33]。不同的DNA標記之間既有共同之處，又具有各自獨特的優(yōu)勢和技術特點。近年來，由于測序技術的快速發(fā)展以及成本的大幅度降低，最早由Lander提出的第三代分子標記SNP因其高效、快速、穩(wěn)定、可靠等諸多優(yōu)點在相關領域得到快速普遍應用[34]。本項研究采用GBS測序策略首次對銀木進行了SNP標記開發(fā)，并對銀木種子園親本群體進行了親緣關系分析和遺傳多樣性評估，獲得了59個種子園親本之間精確的親緣關系，同時揭示出這些親本組成的群體目前遺傳多樣性處于較低的水平，后續(xù)應該加大優(yōu)良種質資源選擇和收集的力度，豐富銀木基因庫，為我國適宜的銀木種植區(qū)域提供良種。

目前，重慶市大足區(qū)已推廣銀木良種造林面積達60.67 hm2，銀木種子園項目充分利用了自然條件的優(yōu)勢，在提高經(jīng)濟效益和社會效益的同時，亦能保護生態(tài)環(huán)境。全面推廣銀木良種和栽培技術必將推動重慶市林業(yè)產(chǎn)業(yè)乃至重慶市經(jīng)濟的快速發(fā)展和農(nóng)村經(jīng)濟總量的快速增長。