潘夏艷　朱鳳　周晨　于俊杰　俞咪娜　宋天巧　曹慧娟　劉永鋒

摘要：前期研究發(fā)現(xiàn)江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑存在抗藥性風險，為進一步明確江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)展規(guī)律，指導全省三唑類殺菌劑的科學使用，利用菌絲生長速率法，測定了2020年江蘇省6個地區(qū)和2021年江蘇省7個地區(qū)共計219個稻曲病菌單孢菌株對三唑類殺菌劑的敏感性，并通過測定抗性菌株的生長速率和對水稻的致病力對其適合度進行了分析。結果表明，2020年采集的84株稻曲病菌對丙環(huán)唑均敏感；2021年，在靖江市監(jiān)測到1株抗藥性菌株，該市抗性頻率為6.7%，全省抗性頻率為0.7%；抗性水平2.2倍。進一步對篩選到的稻曲病菌抗藥性菌株適合分析發(fā)現(xiàn)，抗藥性菌株生長和致病力與敏感菌株相比均無顯著差異，表明在三唑類殺菌劑的田間選擇壓下，抗藥性可能會進一步發(fā)展。本研究明確了江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑存在低抗藥性風險，目前在做好抗藥性監(jiān)測的前提下，三唑類殺菌劑可繼續(xù)作為江蘇省防治稻曲病的主要藥劑。

關鍵詞：稻曲病菌；三唑類殺菌劑；抗藥性；適合度

中圖分類號：S482.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0134-05

稻曲病是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens，有性態(tài)Villosiclava virens）侵染水稻穗部引起的一種世界性真菌病害［1-2］。稻曲病不僅造成水稻嚴重減產(chǎn)，而且稻曲病菌分泌的毒素會對人畜造成一定的毒害作用［3-5］。近年來由于雜交水稻品種的推廣種植、化學肥料的過度使用等因素，我國水稻種植區(qū)稻曲病危害不斷加重，嚴重威脅我國糧食安全［6-9］。利用三唑類殺菌劑對稻曲病進行綜合防控是當下控制該病害流行的重要措施［10-12］。然而，隨著三唑類殺菌劑長期、廣泛被使用，筆者所在課題組自2015年起已在江蘇省多地監(jiān)測到稻曲病菌對三唑類殺菌劑的田間抗藥性菌株，且具有較高的適合度，表明江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑存在抗藥性風險［13-15］。為進一步明確江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生分布范圍和抗藥性發(fā)展規(guī)律，本研究連續(xù)2年監(jiān)測了江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性，評估了三唑類殺菌劑防治稻曲病的抗性風險，以期為生產(chǎn)上三唑類殺菌劑的科學使用及抗藥性治理策略的制定提供理論指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑和菌株

丙環(huán)唑原藥由南京農(nóng)業(yè)大學提供，用甲醇配成10 g/L的母液，于4 ℃冰箱貯存，備用。

2020年供試菌株為84株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、揚州市儀征市、南京市、南通市、泰州市靖江市和鹽城市東臺市6個地區(qū)，采樣水稻品種為南粳5055、南粳9108、金粳818、徽兩優(yōu)絲苗、春優(yōu)301、隆兩優(yōu)1686、深兩優(yōu)5814和淮稻5號等12個水稻品種。具體采樣情況如表1所示。2021年供試菌株共計135株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、南京市、淮安市、連云港市、鹽城市東臺市、南通市和泰州市靖江市7個地區(qū)，采樣水稻品種為南粳系、荃優(yōu)系、徐稻系、金陵香粳、金香玉1號、鹽粳7號、淮稻5號等20多個水稻品種。具體采樣情況如表2所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 稻曲病菌單孢菌株的分離 用滅菌手術刀將稻曲球?qū)Π肭虚_，無菌牙簽挑取稻曲球中部白色菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA： 1 L中含200 g馬鈴薯煮沸過濾液、20 g蔗糖和15 g瓊脂粉）平板上，于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的PSB培養(yǎng)液中，28 ℃、150 r/min搖培5 d后，吸取孢子液顯微觀察產(chǎn)孢情況并將孢子液調(diào)至濃度為1.0×104 個/mL，取 1 μL 上述孢子液于100 μL無菌水中混勻后涂布于PSA平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d，單個孢子萌發(fā)形成的菌落即為稻曲病菌單孢菌株，保存于試管中備用。

1.2.2 稻曲病菌抗藥性菌株的篩選 綜合分析筆者所在研究室2018年建立的江蘇省稻曲病菌對丙環(huán)唑的敏感性基線［4］和測定的田間稻曲病菌敏感菌株對丙環(huán)唑最小抑制濃度（MIC）0.5 mg/L，本研究將1.0 mg/L作為稻曲病菌對丙環(huán)唑田間抗藥性監(jiān)測標準，即能在1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑的抗藥性菌株，不能在含 1.0 mg/L 丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑敏感菌株。將供試菌株在28 ℃培養(yǎng)箱倒置預培養(yǎng)15 d，制成5 mm的菌碟后接種于含1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板中央，28 ℃倒置培養(yǎng)20 d，觀察菌株生長情況。每個處理重復3次。

1.2.3 稻曲病菌對三唑類殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定稻曲病菌對三唑類殺菌劑的敏感性［16］，具體步驟如下：將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d，取直徑5 mm菌齡一致的菌碟轉(zhuǎn)移至含系列濃度梯度的丙環(huán)唑PSA平板（直徑為6 cm）中央，甲醇為陰性對照，丙環(huán)唑濃度梯度設置為0.019 5、0.078 1、0.312 5、1.25、5 mg/L。每個濃度梯度3個重復，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，20 d后測量供試菌株在不同濃度含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，并用DPS軟件計算丙環(huán)唑?qū)Ω鞴┰嚲甑囊种浦袧舛菶C50值。本試驗重復3次

1.2.4 抗性水平劃分 按照以下公式計算三唑類殺菌劑的抗性頻率和抗性水平。

抗性頻率=（抗藥性菌株數(shù)/總菌株數(shù)）×100%；

抗性水平=供試稻曲病菌EC50/平均EC50值（平均EC50值為2018年本研究室建立的敏感性基線0.05 mg/L）。

當抗性水平≤1時，該菌株為敏感菌株，當抗性水平>1且≤5時，該菌株為低抗菌株，當抗性水平>5且≤10為中抗菌株，當抗性水平＞10時，該菌株為高抗菌株。

1.2.5 抗藥性菌株適合度分析 （1）生長速率測定：將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d，取直徑5 mm的菌碟于PSA平板中央，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d后測量菌落直徑并拍照，SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。每個處理3個重復，本試驗重復2次。（2）致病力測定：參照俞咪娜等的方法［17］稍作修改，取新鮮的供試菌株的菌碟于PSB培養(yǎng)液中于28 ℃、150 r/min搖培5 d后，顯微觀察孢子濃度并調(diào)至1.0×106個/mL，然后將菌絲塊和孢子液一起打碎作為接種體，注射器接種1 mL接種體至破口前5～7 d的兩優(yōu)培九穗苞中，每個菌株接種10穗，接種30 d后調(diào)查每穗稻曲球數(shù)并拍照，SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。本試驗重復2次。

2 結果與分析

2.1 江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測

本研究共分離獲得2020年來自江蘇省6個地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株84株，2021年來自江蘇省7個地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株135株，總計219株。對其抗藥性監(jiān)測結果表明：2020年所有菌株均為敏感菌株，2021年靖江市有1株菌株能在1.0 mg/L含丙環(huán)唑的平板上生長，為稻曲病菌對丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株，江蘇省稻曲病菌對丙環(huán)唑的抗性頻率為0.7%，靖江市抗性頻率為6.7%（表3）。

2.2 稻曲病菌對三唑類殺菌劑敏感性測定和抗性水平分析

對篩選獲得的稻曲病菌抗藥性菌株2021-128進行了丙環(huán)唑敏感性測定（圖1），得出2021-128對丙環(huán)唑的EC50值為0.11 mg/L，抗性水平為2.2倍，為低抗菌株。

2.3 稻曲病菌抗性菌株適合度分析

對稻曲病菌抗藥性菌株生長速率和致病力測定發(fā)現(xiàn)，抗藥性菌株2021-128與敏感菌株2021-30相比，生長速率（圖2-A、圖2-B）和致病力（圖2-C、圖2-D）均無顯著差異，表明該抗藥性菌株田間適合度沒有降低。

3 討論

稻曲病主要依賴于化學藥劑防控，防治關鍵時期為水稻穗期，即破口前5～7 d施用丙環(huán)唑、戊唑醇等三唑類殺菌劑和井岡霉素為主［18-21］。在其他糧食作物和經(jīng)濟作物病害病原菌中，三唑類殺菌劑的抗性屢見報道，如小麥褐銹菌（Puccinia triticina）、柑橘綠霉病菌（Penicillium digitatum）、瓜類白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、大麥白粉病菌

graminis f. sp. hordei）等都對三唑類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［22-24］。王菲等人曾通過室內(nèi)紫外誘變的方法，成功獲得稻曲病菌對戊唑醇的抗藥性菌株［25］。筆者所在研究室通過對稻曲病菌對三唑類殺菌劑多年的田間抗藥性監(jiān)測，于2015年在江蘇省淮安市首次監(jiān)測到2株稻曲病菌對丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株［13］，2017年在江蘇省徐州市、淮安市和常州市金壇區(qū)以及2019年在江蘇淮安市、徐州市、常州市金壇區(qū)和連云港市多地均監(jiān)測到稻曲病菌對丙環(huán)唑田間抗藥性菌株，且部分抗藥性菌株田間適合度高，表明稻曲病菌對三唑類殺菌劑可能存在抗藥性風險［14-15］。因此，探明江蘇省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性病原群體發(fā)生發(fā)展規(guī)律，對指導科學使用三唑類殺菌劑、高效防控稻曲病具有重要意義。

本研究繼續(xù)監(jiān)測了2020—2021年江蘇省田間稻曲病菌對三唑類殺菌劑的敏感性，結果表明2020年江蘇省各地區(qū)未監(jiān)測到田間抗藥性菌株；2021年于江蘇省靖江市監(jiān)測到1株田間抗藥性菌株，抗性頻率低，且為低抗藥性菌株。這表明稻曲病菌對三唑類殺菌劑的田間抗藥性發(fā)展較慢，目前還沒有呈動態(tài)上升發(fā)展趨勢。但是2021年監(jiān)測到的抗藥性菌株適合度較高，在田間三唑類殺菌劑選擇壓力下，田間抗性可能會發(fā)展較快。此外，值得注意的是，較往年，靖江市為新增監(jiān)測到田間抗藥性菌株的地區(qū)。從2015年至今，稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生范圍已從淮安市擴展到徐州市、常州市金壇區(qū)、連云港市以及泰州市靖江市，主要集中在蘇北地區(qū)。綜上，盡管稻曲病菌對三唑類殺菌劑抗藥性發(fā)展緩慢，但介于抗藥性菌株的田間適合度和擴展范圍，仍需加強我省稻曲病菌對三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測，了解抗藥性病原群體變化動態(tài)，及時采取不同的抗藥性治理策略，延緩抗藥性的發(fā)生發(fā)展，從而延長三唑類殺菌劑在我省稻曲病防控中的使用壽命。

參考文獻：

［1］Ou S H. Rice Disease［R］. London：Common Wealth Mycological Institute，1972：288-295.

［2］Tanaka E，Ashizawa T，Sonoda R，et al. Villosiclava virens gen. nov.，comb. nov.，the teleomorph of Ustilaginoidea virens，the causal agent of rice false smut［J］. Mycotaxon，2008，106：491-501.

［3］曹奎榮，鐘雪明，陳 婕，等. 稻曲病對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學，2018，59（10）：1868-1870.

［4］Li P X，Evans C D，Wu Y Z，et al. Evolution of the total syntheses of ustiloxin natural products and their analogues［J］. Journal of the American Chemical Society，2008，130（7）：2351-2364.

［5］Luduena R F，Roach M C，Prasad V，et al. Interaction of ustiloxin-A with bovine brain tubulin［J］. Biochemical Pharmacology，1994，47（9）：1593-1599.

［6］Zhang Y，Zhang K，F(xiàn)ang A F，et al. Specific adaptation of Ustilaginoidea virens in occupying host florets revealed by comparative and functional genomics［J］. Nature Communications，2014，5：3849-3860.

［7］Qiu J H，Meng S，Deng Y Z，et al. Ustilaginoidea virens：a fungus infects rice flower and threats world rice production［J］. Rice Science，2019，26（4）：199-206.

［8］陳 旭，邱結華，熊 萌，等. 稻曲病研究進展［J］. 中國稻米，2019，25（5）：30-36.

［9］楊曉杰，張少華，李為爭，等. 糧食作物病蟲害用藥規(guī)律——基于對應分析途徑的簡明圖解［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（7）：1-9.

［10］陶友權. 水稻稻曲病的發(fā)生規(guī)律與綜合防控策略［J］. 安徽農(nóng)學通報，2019，25（14）：80-81.

［11］王 昆，曹友仁，李振興，等. 不同藥劑防治水稻稻曲病田間藥效試驗［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2022（4）：50-52.

［12］許淑蓮. 稻曲病的發(fā)生與防治［J］. 現(xiàn)代農(nóng)村科技，2019（6）：32-33.

［13］Zhou Y X，Li H H，Yu J J，et al. First report of propiconazole resistance in field isolates of Ustilaginoidea virens on rice in Jiangsu Province of East China［J］. Plant Disease，2017，101（5）：840-841.

［14］Zhou Y X，Yua J J，Pan X Y，et al. Characterization of propiconazole field-resistant isolates of Ustilaginoidea virens［J］. Pesticides Biochemistry and Physiology，2108，153：144-151.

［15］Pan X Y，Cao H J，Yu J J，et al. Monitoring and analysis of rice pathogen Ustilaginoidea virens isolates with resistance to sterol demethylation inhibitors in China［J］. Phytopathology Research，2020，2：4.

［16］潘夏艷，朱 鳳，齊中強，等. 江蘇省稻瘟病菌對稻瘟靈的抗藥性監(jiān)測及特性分析［J］. 植物病理學報，2022，52（3）：416-424.

［17］俞咪娜，于俊杰，曹慧娟，等. 稻曲病病菌Zn2（Ⅱ）Cys6型轉(zhuǎn)錄因子UvZC1基因的克隆及功能分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2021，37（6）：1400-1408.

［18］Fan J，Yang J，Wang Y Q，et al. Current understanding on Villosiclava virens，a unique flower-infecting fungus causing rice false smut disease［J］. Molecular Plant Pathology，2016，17（9）：1321-1330.

［19］杜一平. 稻曲病的發(fā)生與防治［J］. 現(xiàn)代農(nóng)村科技，2020（10）：37.

［20］杜元中. 水稻稻曲病的發(fā)病因素及防控措施［J］. 農(nóng)技服務，2021，38（7）：82-83.

［21］邢 艷，王 軍，楊 娟，等. 水稻稻曲病的發(fā)生規(guī)律及防治方法［J］. 植物醫(yī)生，2021，34（4）：67-71. [HJ2mm]

［22］Price C L，Parker J E，Warrilow A G S，et al. Azole fungicides-understanding resistance mechanisms in agricultural fungal pathogens［J］. Pest Management Science，2015，71（8）：1054-1058.

［23］Schepers H T A M. Fitness of isolates of Sphaerotheca fuliginea resistant or sensitive to fungicides which inhibit ergosterol biosynthesis［J］. Netherlands Journal of Plant Pathology，1985，91：65-76.

［24］Tucker M A，Lopez-Ruiz，F(xiàn)，Cools H J，et al. Analysis of mutations in West Australian populations of Blumeria graminis f. sp. hordei CYP51 conferring resistance to DMI fungicides［J］. Pest Management Science，2019，76（4）：1265-1272.

［25］Wang F，Lin Y，Yin W X，et al. The Y137H mutation of VvCYP51 gene confers the reduced sensitivity to tebuconazole in Villosiclava virens［J］. Scientific Reports，2015，5：17575-17587.

收稿日期：2022-11-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：32001943）。

作者簡介：潘夏艷（1990—），女，江蘇常熟人，博士，助理研究員，研究方向為植物病害防控。E-mail：panxy@jaas.ac.cn。

通信作者：劉永鋒，博士，研究員，研究方向為水稻病害病原菌致病機制及綠色防控技術。E-mail：liuyf@jaas.ac.cn。