張麗萍，何志艷，蘇東文，鮑艷媛，謝招虎，向 前，李兆福，4△

（1.云南省滇南中心醫(yī)院紅河哈尼族彝族自治州第一人民醫(yī)院，云南 個(gè)舊 661000；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；3.彌勒市人民醫(yī)院，云南 彌勒 652300；4.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是因尿酸排泄功能異常和（或）嘌呤代謝異常引起血尿酸升高，單鈉尿酸鹽晶體在關(guān)節(jié)、滑膜或其它組織、器官等部位沉積，沉積部位出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的急性炎癥反應(yīng)，屬于晶體性關(guān)節(jié)炎范疇[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，近年來(lái)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升。流行病學(xué)顯示，痛風(fēng)患者男女性別之比為15 ∶1，發(fā)病的平均年齡為48.28歲[2]，不同種族痛風(fēng)的發(fā)病率約為0.03%～15.3%[3]，在中國(guó)，痛風(fēng)患病率約為1%～3%，并且發(fā)病呈逐漸上升和年輕化趨勢(shì)[4]。GA 具有致殘性，且高尿酸血癥和心腦血管、痛風(fēng)性腎病等疾病的發(fā)病關(guān)系密切，已成為世界范圍內(nèi)醫(yī)療領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

既往研究提示GA 的發(fā)病和炎癥反應(yīng)、高尿酸血癥息息相關(guān)，但GA 的發(fā)病機(jī)制尚未完全被人們所知曉。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）與多種炎癥信號(hào)通路有關(guān)，并且參與了多種代謝性疾病和風(fēng)濕免疫病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)GA 的急性發(fā)作可能和LncRNA 的表達(dá)譜有關(guān)[7]，LncRNA 的異常表達(dá)可能是GA 急性發(fā)作的關(guān)鍵因素之一，其可能參與了GA 發(fā)作的炎癥反應(yīng)過(guò)程。因此，從LncRNA 的表型差異角度探討痛風(fēng)的發(fā)病及防治可能是以后中西醫(yī)研究的關(guān)鍵點(diǎn)?；诖耍狙芯繑M探討LncRNA 的表型在AGA 發(fā)病中的作用，為臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)標(biāo)本 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的AGA（濕熱蘊(yùn)結(jié)型）患者及非痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎健康人（healthy control，HC）的血液標(biāo)本。

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑 50 mL、15 mL、1.5 mL 普通離心管；50 mL 高效離心管；高原真空采血管（10 mL枸櫞酸鈉）；各量程移液器；吸頭（1 000 μL、200 μL等）；PCR 管（0.2 mL、1.5 mL）；Sep Mate TM tube（15 mL、50 mL）；-81℃冰箱；普通冰箱（4℃、-20℃）；制冰機(jī)；漩渦振蕩儀；超凈工作臺(tái)；高速冷凍離心機(jī)；淋巴細(xì)胞分離液；FBS；DPBS；Trizol 總RNA 提取試劑盒；PCR 相關(guān)引物；乙醇；氯仿。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病例來(lái)源 選擇來(lái)自門(mén)診的符合病例納入標(biāo)準(zhǔn)的AGA 患者5 例和來(lái)自門(mén)診體檢的HC 5 例。

2.2 方法 AGA 患者5 例，予清熱通絡(luò)方配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司）治療5 d，藥物由淡竹葉10 g，石膏30 g，南沙參20 g，黃柏15 g，薏苡仁30 g，法半夏15 g 等10 余味藥物組成（每劑320 g）；HC 組5例不予任何處理；AGA 服藥后轉(zhuǎn)為NAGA（Non-acute gouty arthritis）組。采集AGA 組、HC 組、NAGA 組的外周空腹靜脈血7 mL（EDTA-K2 抗凝）。

2.3 標(biāo)本采集和處理

2.3.1 PBMC 的分離 將7 mL 的新鮮血液用移液器轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，加入同等量的DPBS 后輕輕搖晃使2 者混勻；將50 mL 高效離心管置于離心管架上，用移液器將淋巴細(xì)胞分離液緩慢加入高效離心管中間的小孔中，連續(xù)緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液，直至液面沒(méi)過(guò)離心管的隔板；將和DPBS 混勻后的血漿沿著高效離心管的管壁緩慢加入高效離心管中后靜置5 min；稱取上一步高效離心管的重量，配平后放入高效離心機(jī)進(jìn)行離心（3 500 r/min，離心20 min）；離心結(jié)束后將離心管緩慢取出置于離心架上，可見(jiàn)高效離心管分為4 個(gè)層面（最底層為沉積的紅細(xì)胞，倒數(shù)第2 層為分離液，倒數(shù)第3 層為PBMCs，倒數(shù)第4層為血清），此時(shí)用移液槍吸去最頂層的淡黃色液體，將倒數(shù)第3 層的PBMCs 移入15 mL 離心管中；15 mL 離心管的重量，配平后離心機(jī)離心（3 500 r/min，離心5 min）；離心結(jié)束后倒去上清液，留下離心管最底層的白色沉積物；用1 mL 的DBPS 將離心管底層的白色沉積物吹散，配平后，重復(fù)上述過(guò)程再離心一次；倒去離心后的上清液，留下白色沉積物，用1 mL DPBS 吹散后，轉(zhuǎn)入1.5 mL 的離心管中；配平后放入小型離心機(jī)繼續(xù)離心（3 500 r/min，離心5 min）；離心結(jié)束棄其上清液，用槍頭吸干白色沉積物周圍的液體，之后用振蕩器振開(kāi)沉積物，并加入1 mL RNA 裂解液，吹打均勻至細(xì)胞完全裂解，室溫靜置5 min，標(biāo)記好信息后放入-81℃冰箱凍存。

2.3.2 總RNA 的提取 取出保存在-81℃中的PBMCs，室溫靜置5 min；加200 μL 氯仿至解凍的PBMCs中，并震蕩15 s 以便核酸、核蛋白能完全分離，室溫靜置10 min；配平后離心（12 000 r/min，離心15 min），離心后可見(jiàn)液體分為3 層，吸取最上層（含有RNA）至新的1.5 mL 的EP 管；往裝有RNA 的1.5 mL EP 中加入等量的異丙醇，混勻后室溫靜置10 min；配平后離心機(jī)離心（12 000 r/min，離心10 min）；離心結(jié)束后吸去上清液，加75%的乙醇1 mL 至1.5 mL 的EP 管中，震蕩混合均勻后，低溫離心（12 000 r/min，離心5 min）；離心后吸去上清液后將離心管倒置風(fēng)干；加入30 μL 左右的無(wú)酶水，混勻后室溫靜置10 min 使RNA 充分溶解后保存到-81℃冰箱中。

2.3.3 基因檢測(cè) 由上海康成生物工程有限公司完成。（1）檢測(cè)RNA 質(zhì)量：降解RNA 并用Agilent ND-1000 檢測(cè)降解是否完全及測(cè)定濃度。（2）RNA 的標(biāo)記、雜交：用Arraystar RNA Flash Labeling Kit 對(duì)RNA 樣本進(jìn)行標(biāo)記，用Agilent SureHyb 對(duì)樣本進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。（3）采集數(shù)據(jù)和對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：洗滌芯片后，用Agilent DNA Microarry Scanner 掃描芯片，讀取數(shù)值后獲得原始數(shù)據(jù)。用軟件Agilent Feature Extraction（v11.0.0.1）采集芯片的探針信號(hào)。用Agilent GeneSpring GX v12.1 軟件對(duì)芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。（4）挑選差異表達(dá)LncRNAs：用v12.1 軟件選取差異表達(dá)的LncRNA（2 組樣本間差異表達(dá)的篩選條件為：P＜0.05 和Fold Change＞2）。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，兩組之間進(jìn)行比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（±s）表示；不符合正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)，以中位數(shù)（P25，P75）即[M（P25，P75）]表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 病例一般情況分析 本部分研究共納入5 例AGA 患者及5 例HC，所有入組對(duì)象均為男性，納入對(duì)象的年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 入組對(duì)象基本情況比較（±s）

表1 入組對(duì)象基本情況比較（±s）

注：AGA 組和HC 組比較，P＞0.05。

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3.2 AGA 組和HC 組的LncRNA 表型差異情況 分別提取AGA 組和HC 組PBMC 中總RNA 并進(jìn)行基因芯片測(cè)序，按照設(shè)定的篩選條件（P＜0.05 和Fold Change＞2），和HC 組比較，AGA 組具有表型差異的LncRNA 共有2 364 條，其中1 174 條表達(dá)上調(diào)，1 190 條表達(dá)下調(diào)。AGA 組表達(dá)上調(diào)的前10 位見(jiàn)表2，表達(dá)下調(diào)的前10 位見(jiàn)表3，具有表型差異的火山圖見(jiàn)圖1、聚類分析圖見(jiàn)圖2。

圖1 和HC 組比較，AGA 組有表型差異的火山圖

圖2 和HC 組比較，AGA 組有表型差異的聚類分析圖

表2 和HC 組比較，AGA 組表達(dá)上調(diào)的LncRNA

表3 和HC 組比較，AGA 組表達(dá)下調(diào)的LncRNA

3.3 NAGA 組和HC 組的LncRNA 表型差異情況 提取NAGA 組PBMC 中總RNA 并進(jìn)行基因芯片測(cè)序，按照設(shè)定的篩選條件（P＜0.05 和Fold Change＞2），與HC 組比較，NAGA 組具有表型差異的LncRNA 共有802 條，其中147 條表達(dá)上調(diào)，655 條表達(dá)下調(diào)。NAGA 組表達(dá)上調(diào)的前10 位見(jiàn)表4，表達(dá)下調(diào)的前10位見(jiàn)表5，具有表型差異的火山圖見(jiàn)圖3、聚類分析圖見(jiàn)圖4。

圖3 和HC 組比較，NAGA 組有表型差異的火山圖

圖4 和HC 組比較，NAGA 組有表型差異的聚類分析圖

表4 和HC 組比較，NAGA 組表達(dá)上調(diào)的LncRNA

表5 和HC 組比較，NAGA 組表達(dá)下調(diào)的LncRNA

3.4 NAGA 組和AGA 組的LncRNA 表型差異情況 通過(guò)和AGA 組比較，按照設(shè)定的篩選條件（P＜0.05 和Fold Change＞2），NAGA 組具有表型差異的LncRNA 共有171 條，其中30 條表達(dá)上調(diào)，141 條表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的前10 位見(jiàn)表6，表達(dá)下調(diào)的前10位見(jiàn)表7，具有表型差異的火山圖見(jiàn)圖5、聚類分析圖見(jiàn)圖6。

圖5 和AGA 組比較，NAGA 組有表型差異的火山圖

圖6 和AGA 組比較，NAGA 組有表型差異的聚類分析圖

表6 和AGA 組比較，NAGA 組表達(dá)上調(diào)的LncRNA

表7 和AGA 組比較，NAGA 組表達(dá)下調(diào)的LncRNA

3.5 AGA 組和NAGA 組具有關(guān)聯(lián)的LncRNA 用維恩圖（VENNY2.1）構(gòu)建AGA 組、NAGA 組、HC 組三組之間的聯(lián)系，通過(guò)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)AGA 組、NAGA 組共有79 條LncRNA 存在關(guān)聯(lián)。在AGA 組表達(dá)下調(diào)，而在NAGA 組表達(dá)上調(diào)的LncRNA 共有11 條；在AGA組表達(dá)上調(diào)，而在NAGA 組表達(dá)下調(diào)的LncRNA 共有68 條；排名前10 位的LncRNA 情況見(jiàn)表8、表9；三組之間的思維導(dǎo)圖見(jiàn)圖7。

圖7 AGA 和NAGA 具有關(guān)聯(lián)的LncRNA 思維導(dǎo)圖

表8 AGA 組和NAGA 組具有關(guān)聯(lián)的LncRNA 情況1

表9 AGA 組和NAGA 組具有關(guān)聯(lián)的LncRNA 情況2

4 討論

本研究結(jié)果顯示：（1）AGA 患者和HC 的LncRNA 表達(dá)譜具有明顯差異，AGA 患者有表達(dá)差異的LncRNA 共有2 364 條，1 174 條表達(dá)上調(diào)，1 190 條表達(dá)下調(diào)，其中LINC01503 較HC 表達(dá)上調(diào)了27 倍，T024665 較HC 表達(dá)下調(diào)了11 倍。（2）NAGA 患者和HC 的LncRNA 表達(dá)譜有明顯差異，NAGA 患者有表達(dá)差異的LncRNA 共有802 條，147 條表達(dá)上調(diào)，655條表達(dá)下調(diào)，其中AL031056.1 較HC 表達(dá)上調(diào)了3.7倍，G005378 較HC 表達(dá)下調(diào)了17 倍。（3）AGA 患者和NAGA 患者的LncRNA 表達(dá)譜具有明顯差異，具有表達(dá)差異的LncRNA 共171 條，AGA 患者表達(dá)上調(diào)的有30 條，NAGA 患者表達(dá)下降的有141 條，AGA患者表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的LncRNA 為AC073486.1，其上調(diào)了2.8 倍，AP001434.1 是NAGA 患者下調(diào)倍數(shù)最高的，下調(diào)了5.8 倍。（4）通過(guò)構(gòu)建AGA 組、NAGA 組、HC 組3 組之間的聯(lián)系，我們發(fā)現(xiàn)存在關(guān)聯(lián)的LncRNA 共有79 條。11 條LncRNA 在AGA 組表達(dá)下調(diào)，而在NAGA 組表達(dá)上調(diào)，其中AC100814.1在AGA 組下調(diào)3 倍，在NAGA 組表達(dá)上調(diào)了2.7 倍；68 條LncRNA 在AGA 組表達(dá)上調(diào)，在NAGA 組表達(dá)下調(diào)，其中AL031056.1 在AGA 組上調(diào)11 倍，在NAGA 組表達(dá)下調(diào)了3 倍。研究提示LncRNA 的表型差異可能和痛風(fēng)的急性發(fā)作有關(guān)。

傳統(tǒng)中醫(yī)并沒(méi)有GA 的病名，根據(jù)本病的發(fā)病特點(diǎn)和臨床表現(xiàn)，大多歸屬于中醫(yī)“腳氣”“白虎病”“痹證”“歷節(jié)”等范疇[8]。諸多中醫(yī)學(xué)者雖對(duì)GA 有不同的認(rèn)識(shí)，但不難發(fā)現(xiàn)，GA 的急性發(fā)作主要和脾虛、濕熱、痰瘀等因素密切相關(guān)[9-14]。

LncRNA 是長(zhǎng)度不低于200 個(gè)核苷酸，沒(méi)有蛋白編碼功能的非編碼RNA 分子序列，是基因轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分[15]。LncRNA 種類繁多、數(shù)量龐大，可以通過(guò)多種形式參與調(diào)控基因的表達(dá)模式，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及蛋白編碼水平發(fā)揮著重要作用[16]。有研究提示LncRNA 與多種炎癥信號(hào)通絡(luò)有關(guān)，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)LncRNA 參與了炎癥反應(yīng)、免疫類疾病、腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展[17]。

GA 是具有遺傳傾向的和多種外界因素有關(guān)的復(fù)雜性疾病[18]，在LncRNA 和GA 的研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA 的表達(dá)譜和GA 的發(fā)病有關(guān)[19]，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于LncRNA 表達(dá)譜和GA 發(fā)病機(jī)制的報(bào)道不多，目前人們對(duì)它在GA 發(fā)病過(guò)程中的所扮演的角色及作用機(jī)制尚未明確，期待后續(xù)有更多的學(xué)者加入該研究，以期從新的途徑了解GA，找到有效診治及預(yù)防該病的方法。